肿瘤细胞外囊泡代谢组学研究进展9821.pdf

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1、肿瘤细胞外囊泡代谢组学研究进展 细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）是一种具有双层磷脂膜结构的囊泡小体，EV 从其大小及分离方式上可以分为小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEV）和大细胞外囊泡（large extracellular vesicles，lEV），而从其产生方式上又可以分为外泌体、微囊泡、凋亡小体等1。EV 能够特异地将来源细胞的蛋白质、核酸和代谢物等物质包裹在内，它们作为 EV 携带的“货物”，一方面能够作为标志物反映来源细胞的状态，另一方面也能够在细胞间传递信息，诱导靶细胞的生命活动发生改变2。此外本团队的前

2、期研究也证实 EV 在肿瘤的远处转移中也发挥着重要作用3。细胞代谢的改变是肿瘤的重要特征，肿瘤细胞可以通过这些改变来满足自身快速生长的需求。小分子代谢物是与细胞表型和状态最直接相关的分子，随着研究的深入，人们越来越认识到了代谢组学在肿瘤中的重要价值4。然而目前肿瘤 EV 的相关报道大都集中于 RNA 和蛋白，EV 代谢组学研究还相对欠缺。一、肿瘤来源 EV 的代谢组学特征 首先，与来源细胞相比，EV 含有更多的脂质（每毫克蛋白所含脂质约为细胞的 8.4 倍）5，且普遍存在胆固醇、鞘糖脂、鞘磷脂等脂质的富集 6，这一点在前列腺癌 5，7、结直肠癌8和乳腺癌9细胞来源的 EV 中都得到了证实。此外

3、 EV 还会特异性富集一些脂质，例如有研究发现，溶血磷脂酰胆碱会在前列腺癌 LnCap 细胞来源的 EV 中富集，但其在 LnCap 细胞中的丰度却很低。此外不同 EV 亚类携带的代谢物组成也是不同的，有研究者认为糖脂和游离脂肪酸的富集是 sEV 的特征，而神经酰胺和鞘磷脂的富集则是 lEV 的特征10，另外 Yang 等11的研究也发现尿液来源的 sEV 与 lEV 的脂质组成存在差异性，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸等在 sEV 中比 lEV 中更丰富，造成上述差异的原因可能是不同 EV 亚类的发生方式不同。与正常细胞来源的 EV 相比，肿瘤细胞来源 EV 携带的代谢物也存在着差

4、异，其中研究最多的是脂质。溶血磷脂能够通过多种不同的机制参与肿瘤进展12,13。目前有研究证明卵巢癌 SKOV-3 细胞来源的 EV 存在溶血磷脂酰胆碱的富集14，且高浓度的 EV 溶血磷脂酰胆碱还与乳腺癌较短的总生存期相关15。但也有研究发现一些溶血磷脂如溶血磷脂酰乙醇胺在肾细胞癌患者尿液来源的 EV 中丰度更低16。另有研究发现神经酰胺和鞘磷脂也会在某些来自肿瘤细胞的 EV 中富集10，且这一现象在黑色素瘤和肺癌细胞来源的 EV 中也得到了证实17,18。此外，胆固醇酯、酵母固醇和 27-羟基胆固醇等脂质的富集也曾在肿瘤来源的 EV 中被报道14，19。相对而言，肿瘤来源 EV 携带的其他

5、小分子代谢物的研究还相对较少。有研究发现与非肿瘤细胞相比，来自肿瘤细胞系的 EV 含有更多的氨基酸及其衍生物，其中脯氨酸和琥珀酸上调最为显著，另外该研究还发现在前列腺癌细胞和 T 细胞淋巴瘤细胞来源的 EV 中能够检测到更多的叶酸和肌酐20。此外还有研究发现来自头颈鳞癌细胞系 UMSCC47 培养上清液的 EV 富含腺苷等嘌呤代谢产物21，这一现象在胰腺癌中也有报道22。这些肿瘤 EV 携带代谢物的特异性改变（图 1）为其作为肿瘤诊断标志物奠定了基础。图 1 EV 携带的代谢物影响肿瘤及基质细胞功能 不同肿瘤细胞来源 EV 的代谢物组成也发生着变化。例如，肝癌细胞系 Huh7 和间充质干细胞

6、MSC 来源的 EV 存在心磷脂的特异性富集，而脑胶质瘤细胞系 U87 来源的 EV 则被发现存在鞘磷脂的富集10。另外一项乳腺癌相关的研究也表明，与低转移性细胞相比，高转移性乳腺癌 EV 中不饱和二酰基甘油存在富集，脂质被选择性地装载到乳腺癌 EV中 9。此外，不同耐药表型 23、不同肿瘤亚型 24,25以及不同分化程度26肿瘤细胞来源 EV 所携带的代谢物也存在差异，这提示 EV 携带的代谢物还可能在肿瘤鉴别诊断中发挥作用，且特异性的 EV 携带的代谢物也许能够用于判断 EV 的来源。以上研究主要探索了细胞培养液中肿瘤来源 EV 的代谢组学特征，值得注意的是，虽然细胞培养液来源 EV 相对

7、临床样本来源 EV 应有更好的一致性，但是有研究发现同种细胞不同氧浓度22、不同 pH17、不同培养系统6等条件也会引起 EV 代谢组学的变化，可见 EV 代谢组学是一个非常灵敏的指标，所以在比较不同细胞系 EV 携带的代谢物的过程中，也需要考虑不同培养条件对其产生的影响。综上，肿瘤来源 EV 的代谢组学表现出独有的特征，且能非常灵敏地反映细胞状态，有可能在肿瘤诊疗中发挥一定作用。二、EV 携带的代谢物作为肿瘤诊断标志物的价值（一）采用 EV 样本进行代谢组学标志物研究的优缺点 与细胞培养液相比，血液及尿液等临床样本具有更大的异质性，但要想评价代谢物作为诊断标志物的价值，使用临床样本开展研究是

8、非常必要的。体液样本和体液来源 EV 样本所富集的代谢物存在差异性27，目前代谢组学诊断标志物研究大多是直接采用体液样本进行分析，分离 EV 后再进行代谢组学研究的还相对较少。这 2 种研究方案各自有其优缺点。从临床应用的难易程度上讲，直接采用体液样本更加快速便捷，而提取 EV 进行分析，增加了前处理过程，提高了成本，因此临床应用难度较大。从诊断效能的优劣上来看，由于体液代谢物含量受饮食及化合物稳定性等多种因素的影响28，所以有囊泡膜保护的 EV 携带的代谢物可能是标志物研究的更好选择。EV是活细胞“主动分泌”的，其代谢物成分具有选择性，可能包含更丰富和特异的信息。此外，EV 表面的许多特异性

9、蛋白还能够用于分离肿瘤特异性的 EV29。因此 EV 样本可能会提供更为同质化的代谢物来源，有利于富集肿瘤细胞的异常代谢改变，进而发现更加敏感和特异的代谢标志物。目前已有一些研究团队对体液代谢组学和体液来源 EV代谢组学的诊断效能进行了比较18，27，30，例如 Puhka等30发现，与尿液相比尿液 EV 样本中存在特异性富集的代谢物，且尿液 EV 携带的代谢物的肿瘤相关改变更加明显。但由于相关报道有限，且大多纳入的样本数量较少，因此直接使用体液样本和使用体液来源的 EV 样本究竟孰优孰劣还有待进一步的评价。（二）EV 携带的代谢物在各系统肿瘤中的研究 1.泌尿系统肿瘤：泌尿系统肿瘤的相关研究

10、大多采用尿液样本，其中研究最多的是前列腺癌（prostate cancer，PCa）。脂质代谢物研究方面，一项研究分析了15 例 PCa 患者和 13 名健康对照者尿液 EV 携带的代谢物，发现 9 种脂类的水平存在差异，其中磷脂酰丝氨酸 181/181 和乳糖神经酰胺 d181/160 的显著性最高，将这 2 种脂质与磷脂酰丝氨酸 180/182 进行组合，可达到 93%的敏感度和 100%的特异度31。另一项研究发现 PCa 患者尿液 EV 中磷脂酰甘油 226/226 明显较高，而甘油二酯 160/160 和161/181 以及许多甘油三酯却明显较低11。而在其他小分子代谢物方面，有研究

11、发现尿液来源 EV 携带的多种脂质和氨基酸在 PCa 和前列腺增生之间表现出明显丰度差异，且 PCa 患者尿液 EV 中硫酸脱氢表雄酮水平明显较高，这与PCa 患者雄激素合成的潜在升高相一致32。此外还有一项研究同时对尿液 EV 和血小板 EV 的代谢组学特征进行了分析，结果发现与对照组相比，前列腺切除术前患者尿液 EV样本中的葡萄糖醛酸、5-磷酸核糖和异丁基-1-肉碱水平明显较低。此外该研究还发现了在尿液 EV 样本中特异性富集的代谢物 谷酰基半胱氨酸，它在血小板 EV 和尿液样本中均未富集，这一发现可能有助于推测 EV 的来源30。除前列腺癌外，也有研究者对肾癌中 EV 代谢组学的诊断价值

12、作了探究，研究发现肾细胞癌患者尿 EV 携带的溶血磷脂酰乙醇胺丰度明显低于正常对照16。2.呼吸系统肿瘤：EV 携带的代谢物在呼吸系统肿瘤中的相关研究主要围绕肺癌展开，2 项研究分别使用了血浆和胸腔积液样本。第一项研究发现，血浆 EV 所携带的包含 7 种脂质在内的特定组合能够对非小细胞肺癌和健康对照进行区分，ROC 曲线下面积（area under the curve，AUC）可达0.80 以上33；随后另一项研究对胸腔积液中的 EV 进行了代谢组学分析，发现 lEV 比 sEV 更能区分恶性胸腔积液，于是研究团队继续探究了胸腔积液 lEV 中一组代谢物（苯丙氨酸、亮氨酸、磷脂酰胆碱 350

13、 和鞘磷脂 443）对肺癌的诊断价值，其 AUC 可达 0.9534。3.消化系统肿瘤：消化系统肿瘤研究主要采用的是血液样本。Zhu 等35的研究证明了一组由 3-尿苷酸、棕榈油酸、棕榈醛和癸酸异丁酯组成的 EV 携带的代谢物可预测食管癌复发，其 AUC 可达 0.98。另一项在胰腺癌中开展的研究发现胰腺癌患者与健康对照者血清 EV 中有多种脂质存在明显差异，进一步分析还发现溶血磷脂酰胆碱 220、磷脂酰胆碱 140/222和磷脂酰乙醇胺160/181与肿瘤分期、CA19-9、CA242 和肿瘤直径有关，且磷脂酰乙醇胺160/181 还与患者的总生存期呈负相关36。此外，还有研究发现高丰度的

14、EV 鞘氨酸、心磷脂、溶血磷脂酰丝氨酸和 1-羟基脂肪酸以及较少的硫酸盐和酰基葡萄糖谷甾醇酯与肝癌密切相关37。4.妇科肿瘤：一项乳腺癌相关研究收集了 78 例乳腺癌患者和 30 名健康对照者的 lEV，利用靶向和非靶向质谱对其代谢组进行了表征，结果发现 8 种代谢物存的差异具有统计学意义，其联合诊断的 AUC 可达 0.78。此外该研究还发现高浓度的溶血磷脂酰胆碱 aC260 和磷脂酰胆碱 aaC385 与乳腺癌较短的总生存期相关15。另外一项研究则是对完整的活细胞和组织中的 EV 直接进行了可视化和表征，结果发现乳腺癌组织内、组织边界和血管周围有大量的富集还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）

15、的 EV，且其百分比与人类乳腺癌的诊断相关38。此外还有研究探索了血浆 EV 代谢组学在子宫内膜癌中的诊断价值，结果也提示患者与健康对照者的 EV 携带的代谢物水平存在差异39。5.其他肿瘤：有研究发现与健康人群来源的 EV 相比，从头颈鳞状细胞癌患者血浆分离的 EV 中富含嘌呤代谢产物，并携带较高水平的腺苷。该研究还发现早期疾病和无淋巴结转移患者的 EV 中腺苷和 5鸟苷酸水平较高，而在晚期和淋巴结受累的患者中嘌呤代谢产物水平较低21，这一发现提示转移活性较强的患者肿瘤细胞代谢活动可能发生了改变，具有重要意义。此外，黑色素瘤患者的血清源 EV 代谢组学与健康对照组相比具有显著差异，其中磷脂酰

16、胆碱160/00 在黑色素瘤患者血清和黑色素瘤干细胞来源的EV 中含量较低26。综上，EV 代谢组学能够灵敏和特异的反映肿瘤状态，在肿瘤诊断方面具有重要意义。三、EV 携带的代谢物调控肿瘤进展的功能 1.促进囊泡摄取：EV 可以通过多种不同的途径与靶细胞相互作用，代谢物尤其是脂质在这个过程中也发挥着非常重要的作用。一方面 EV 可以借助膜上的生物活性脂质与靶细胞表面的受体相互作用直接影响其生命活动 40,41。另一方面 EV 还能通过被受体细胞摄取进而发挥作用 42，目前有研究发现某些肿瘤来源的 EV 表面存在着如 PS43,44、溶血磷脂酰胆碱45,46等标记，并且富含脂筏相关的脂质，能够促

17、进 EV 被靶细胞摄取。2.提供代谢原料：有多项研究发现，EV 携带的代谢物能够作为原料被靶细胞摄取，调控肿瘤细胞的生命活动。例如一项研究发现肿瘤相关纤维母细胞来源 EV 能够以类似于巨胞饮的方式被营养匮乏的肿瘤细胞摄取，向其提供氨基酸等代谢物，抑制细胞氧化磷酸化并增强糖酵解和谷氨酰胺代谢，进而促进肿瘤的增殖47。与之类似，人间充质干细胞 EV 中也发现了谷氨酸和乳酸的富集48。此外，还有研究发现脂肪细胞来源的 EV 能够通过转移脂肪酸促进黑色素瘤细胞的脂肪酸氧化，且这种变化可能还会诱导线粒体重新分配到细胞末端，进而促进肿瘤细胞的迁移49。3.参与细胞通讯：除了提供肿瘤细胞所需的代谢原料，EV

18、 所携带的代谢物也可能作为活性物质发挥作用。有研究发现胰腺癌细胞来源的 EV 能够通过递送脂质抑制 Notch-1 通路进而诱导细胞凋亡50。Yin 等51的研究则发现肿瘤源性 EV 携带的脂肪酸能够通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体，诱导代谢向氧化磷酸化方向转移，从而导致树突细胞免疫功能障碍。Xiang 等52的研究也发现小鼠乳腺癌细胞来源 EV 携带的生物活性脂质如白三烯和前列腺素，可促进癌症骨髓细胞向髓系抑制细胞方向分化，进而诱导免疫抑制。另有研究者发现高转移性乳腺癌的 EV 与低转移性细胞相比，存在不饱和二酰基甘油的富集，富含这种脂质的EV能够激活内皮细胞蛋白激酶D信号通路，刺激血管生

19、成 9。此外，Sagar 等53还发现胰腺癌细胞来源的 EV 能够通过传递肾上腺髓质素促进脂肪分解，从而引起副肿瘤效应。综上，EV 携带的代谢物可以通过促进囊泡的摄取及作为底物或活性物质的方式调控肿瘤细胞及基质细胞的功能，在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。四、讨论与展望 组学研究是当前生命科学领域的热点，其中基因组能够预测未来会发生什么，转录组和蛋白组能够告诉我们可能发生什么，而代谢组能够让我们知道正在或已经发生了什么。上游组学能够引起代谢组学的改变，反过来小分子代谢物也会对上游产生一定影响。相比之下，代谢组学能够更加直接和敏感地反映机体和细胞的状态，它作为 EV 组学研究中的重要组成部分，目

20、前却研究甚少。但随着研究的不断深入，人们发现小分子代谢产物也可以通过 EV 转移到肿瘤细胞或肿瘤微环境的基质细胞中，影响受体细胞的生命活动47，49，51,52,53（图 1），此外特异性富集的 EV 代谢货物还可能用于判断 EV 的来源30并作为肿瘤诊断标志物15，31，33,34,35。然而，这一新兴领域面临着诸多挑战，未来还有大量工作有待开展。1.在标志物研究方面：（1）代谢组学标志物研究既可以直接使用体液样本，也可以使用体液来源的 EV 样本，但是哪种方法的诊断效能更高，还缺乏相关研究的验证；（2）由于许多分析前因素都会对 EV 代谢组学研究产生影响，所以 EV 代谢组学相比其他组学研

21、究应对 EV 纯度有更高的要求，尤其是容易含有脂蛋白污染的血液样本54,55。目前EV 的分离方法多种多样，但是要想获得高纯度的 EV 往往耗时耗力，很难在临床实践中推广；（3）EV 代谢组学研究的靶标，目前主要集中于脂质，且往往需要采用多种标志物组合进行判断15，对其他 EV 携带的代谢物的研究则相对欠缺，这可能是由于脂质在 EV 中丰度更高。虽然有些代谢物在 EV 中的丰度不高，但是这些代谢物可能是被特异性转运到 EV 中的，可能更具有价值，因此还需进一步提高代谢物检测技术的灵敏度，以便探究微量代谢物在肿瘤诊疗中的价值；（4）如何对代谢组学结果进行归一化分析也是一个值得关注的问题，例如有研

22、究提出在尿液样本中使用 EV 相关参数或代谢物占比进行归一化要比使用尿量和肌酐水平等更有价值30，但是究竟哪种方式更好还需要进一步的研究去验证；（5）现有的研究报道大多只是小样本的探索性工作，没有进行大样本临床验证，因此 EV 代谢组学标志物尚待进一步研究。2.在功能学研究方面，同样存在着许多需要解决的问题：（1）EV 携带的代谢物是主动装载的结果还是 EV 中酶类反应的被动产物尚不明了；（2）这些代谢活性物质如何被特异性地包裹到 EV 中并转运至特定受体细胞中的潜在机制，仍需进一步阐明；（3）通过 EV 进行代谢物的递送是否比从微环境中直接获取更加有效，还需要进一步探究；（4）对于不同 EV 携带的代谢物对靶细胞发挥作用的方式及其引起的功能变化方面的了解，也非常有限。综上所述，EV 代谢组学可以作为肿瘤状态的实时快照，虽然这一新兴领域面临着诸多挑战，但其在作为肿瘤诊断与治疗靶点方面具有极大的潜力，有待进一步研究和开发。