纳米生物传感器在新型冠状病毒检测中的应用9307.pdf

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1、纳米生物传感器在新型冠状病毒检测中的应用 2019 新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）是一种在世界范围内快速传播，具有极强传染性的新型冠状病毒1。因而，快速而准确地早期诊断新型冠状病毒肺炎（COVID-19）尤其重要。实时荧光逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）是检测 2019-nCoV RNA的“金标准”和确诊 2019-nCoV 感染的重要病原学证据 2，但该平台具有检测时间长、便携性差等缺点3。纳米生物传感器是一种将纳米

2、材料与生物传感技术相结合的新型生物检测平台。近些年，石墨烯、碳纳米管（carbon nanotube，CNT）等纳米材料由于其独特性质，如比表面积高、微尺寸效应和宏观量子隧道效应等4，被广泛用于构建高性能纳米生物传感器。目前，纳米生物传感器已被广泛应用于核酸4、蛋白质5、葡萄糖6、细菌7、病毒8等的高灵敏检测。本文概述了纳米生物传感器的工作原理及分类，着重综述了近一年来所报道的各种纳米生物传感器在检测 2019-nCoV 中的应用。一、纳米生物传感器的工作原理及分类 纳米生物传感器是一种基于纳米技术和生物传感技术，对检测体系中待测物质的浓度或活性进行检测的电子装置。纳米材料的尺寸既非典型的微观

3、系统亦非典型的宏观系统，因而纳米材料呈现出常规材料不具备的优越性能4。纳米生物传感器将纳米材料作为一种新型生物传感介质，与传统生物传感器相比，体积更小、分析速度更快。纳米生物传感器通常由 3 部分构成，即感受器、换能器和检测器9。感受器的主要功能是对靶标物质进行特异性捕获，如抗体对抗原的特异性捕获，受体对配体分子的特异性捕获等。换能器（如各种电极、光敏管、场效应晶体管等），主要负责将感受器捕获到的特异性生物识别信息转化为易于检测的物理化学信号，如光信号、电信号等。纳米生物传感器换能器的设计中往往会引入纳米材料以提高传感器的检测性能，如石墨烯和 CNT 具有良好的导电性和较大比表面积等特点，因而

4、往往被用来修饰各种电极，以制备性能优越的电化学生物传感器、场效应晶体管（field effect transistor，FET）生物传感器等。检测器，即负责检测并记录各种物理化学信号的传感元件。当检测体系中存在靶标物质时，感受器首先对其进行特异性捕获，随后换能器将这种特异性结合信息进行信号转换（如抗体功能化的 FET 生物传感器将抗原-抗体特异性结合信息转化石墨烯表面电荷密度的改变，即电信号），最后由检测器对换能器获得的特异性物理化学信号进行监测、记录。因为具有了亚微米尺寸级别的换能器、探针（感受器）或者纳米微系统，纳米生物传感器的各项性能大幅提升，但纳米生物传感器目前仍处于基础研究阶段，仍有

5、大量的工作需要推进。纳米生物传感器按换能方式的不同可分为电化学纳米生物传感器、光学纳米生物传感器、热敏纳米生物传感器等；也可以按检测对象的不同分为葡萄糖纳米生物传感器、核酸纳米生物传感器、蛋白质纳米生物传感器等 二、纳米生物传感器在检测 2019-nCoV 中的应用 2019-nCoV 核酸检测和长期监测是评估患者感染阶段以及预测其传染性和预后的重要手段10。国家卫生健康委员会发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）中也明确指出 COVID-19 确诊病例需有病原学证据阳性结果RT-qPCR 检测新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测序与已知的新型冠状病毒高度同源11。因而，RT-qPCR 是

6、目前临床上检测 2019-nCoV 核酸最常用的生物技术，该方法具有特异性好、灵敏度高等优点。然而，该方法不仅检测步骤繁琐，需要高度专业化的实验室，还具有检测周期长等缺点12。因此，RT-qPCR 在即时检测及基层医院的应用方面存在诸多限制，仍然不能完全满足临床需求。相比 RT-qPCR，纳米生物传感器则可用于免扩增、简单快速的 2019-nCoV 检测。以下分别介绍基于 2019-nCoV 核酸检测的纳米生物传感器和基于 2019-nCoV 抗原检测的纳米生物传感器。1.基于 2019-nCoV 核酸检测的纳米生物传感器：基于石墨烯纳米生物传感器检测 2019-nCoV 的研究工作正日益受到

7、关注。Damiati 等 13 在石墨烯工作电极修饰链霉亲和素，随后将与 ORF1ab 基因互补的、生物素标记的 DNA 探针固定到传感器表面，从而构建了可用于 2019-nCoV 检测的石墨烯电化学传感器。该传感器可用于快速、灵敏（约 5105 拷贝/ml）、免 PCR 扩增的 2019-nCoV 检测。最近，Li 等12则报道了一种原位沉积金纳米颗粒、吗啉功能化的石墨烯FET 生物传感器以进一步提高对 2019-nCoV RNA 的检测灵敏度。一方面，金纳米颗粒相比石墨烯可以结合更多的吗啉探针分子；另一方面，吗啉作为一种肽核酸，不带任何电荷，吗啉与 2019-nCoV RdRp 杂交不受静

8、电排斥的影响，因而杂交效率大大提高。该传感器的灵敏度为 2.23105 拷贝/ml，检测速度快（2 min），免 PCR 扩增，仅需 10 l 样本即可完成检测。此外，该传感器还成功实现了 30 份临床样本的检测，结果与 RT-qPCR 高度一致（Kappa 指数可达 0.92）。Alafeef 等14利用石墨烯电化学生物传感器结合电信号读出装置实现了高选择性、灵敏（6.9 103 拷贝/ml）、简单快速的 2019-nCoV N 基因检测。同时，该平台可以以近 100%的准确性和特异性区分 22 例 COVID-19 患者和 26 例健康无症状受试者。Zhao 等15则开发了一种基于对硫杯8

9、芳烃功能化石墨烯的超夹心型电化学生物传感器以用于 2019-nCoV RNA 的高灵敏检测（200 拷贝/ml）。该方法检测成本低，免 PCR 扩增，同时还能与智能手机连接传输检测结果，非常简单便携。此外，该传感器成功用于检测 25 例阳性确诊患者和 8 例康复后复阳患者不同体液来源的 88 份临床样本，检测阳性率分别为 85.5%和 46.2%，明显高于RT-qPCR（56.5%和 7.7%）的检测阳性率。除此之外，基于磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles，MNP）和 DNA 纳米材料的纳米生物传感器检测 2019-nCoV RNA 的工作亦有报道。Tian 等 16

10、基于滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）技术和 MNP 制备了一种光磁纳米生物传感器用于2019-nCoV RdRp 检测，该生物传感器的检测限约为2.41105 拷贝/ml，可区分 2019-nCoV 与严重急性呼吸道综合征冠状病毒。Chaibun 等17则构建了一种基于 RCA 的超灵敏电化学生物传感器用于快速检测 2019-nCoV RNA。该传感器检测 2019-nCoV N 和 S 基因的最低检测限均为 103 拷贝/ml，可成功将其用于 106 份临床样本的实际检测中，与RT-qPCR 的检测结果一致性可达 100%。以上报道的纳米生物传感器

11、虽然具有免 PCR 扩增等优点，但大多便携性不好、成本较高，在偏远贫困地区并不适用。值得欣慰的是，基于规律成簇的间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）、一系列 CRISPR 相关蛋白（Cas）研发的侧向层析平台最近被越来越多的报道证实其可用于低成本、便携、快速的 2019-nCoV RNA 检测18,19,20。Broughton 等18报道了一种可用于简单快速（45 min）检测呼吸道拭子中 2019-nCoV RNA 的 CRISPR-Cas12a 侧向层析平台（命名为 DETECT

12、R）。与 RT-qPCR 不同的是，Broughton 等18利用逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）技术对靶基因进行一步逆转录和扩增，大大缩短了检测时间。该平台主要是基于 Cas12a-gRNA（2019-nCoV N/E 基因特异性向导 RNA）复合物中的 gRNA 特异性识别并结合靶基因，有效激活 Cas12a蛋白的核酸酶切活性，从而酶切检测体系中荧光探针，使得体系荧光得到有效恢复的原理。基于以上原理及免疫胶体金层析技术，Broughton 等18成功将其用于 83

13、 份临床样本的实际检测，阳性病例、阴性病例与 RT-qPCR 检测结果的一致性分别可达 95%和 100%。该平台实现 2019-nCoV RNA 检测仅需一根“试纸条”和简易的荧光读出设备，因而实用性和便携性好，适用于各种需要即时诊断的场景。Kellner 等 19则制备了一种基于 CRISPR-LwaCas13a 的 SHERLOCK 检测平台。该平台的基本原理与DETECTR类似，不同的是该平台利用RPA（重组酶聚合酶扩增）技术直接对病毒 RNA 进行等温扩增，最终进入 CRISPR-LwaCas13a 体系实现检测。该平台的检测灵敏度为 104105 拷贝/ml，检测时间仅需 1 h

14、左右。除此之外，还有 AIOD-CRISPR 等平台，但检测原理大同小异 20。基于 2019-nCoV 核酸检测的纳米生物传感器及 RT-qPCR 之间的比较见表 1。目前大部分报道的 2019-nCoV 核酸纳米生物传感器相比 RT-qPCR 虽然具有免 PCR 扩增、检测时间短等优势，但标本前处理过程中仍需提取病毒 RNA。同时，这些纳米生物传感器的灵敏度并不能媲美 RT-qPCR，不能完全满足临床需求。因而，基于 2019-nCoV 核酸检测的纳米生物传感器的研究工作仍有待进一步推进，可通过巧妙设计各种信号放大策略，以进一步提高其检测灵敏度，同时优化检测流程以缩短其检测时间。2.基于

15、2019-nCoV 抗原检测的纳米生物传感器：近些年来，基于石墨烯的 FET 纳米生物传感器已被广泛用于各类物质的直接检测。因而，用于 2019-nCoV 直接检测的石墨烯 FET生物传感器的研发一直是 COVID-19 疫情暴发以来广大研究人员关注的热点领域。COVID-19 疫情暴发不久，Seo 等 21报道了一种 2019-nCoV 刺突蛋白（S 蛋白）抗体功能化的石墨烯 FET 生物传感器。当标本中存在 2019-nCoV 时，其 S 蛋白与传感器表面的抗体特异性结合，由于 S 蛋白带有负电荷，因而可引起石墨烯表面电荷密度的改变，最终通过监测反应前后的电学信号改变即可实现检测。由于石墨

16、烯对微小电荷改变十分敏感，因而即使是微量的 2019-nCoV 存在于体系中也可以被检出。该传感器检测限为 1 fg/ml，无需核酸提取与扩增，可直接实现对 2019-nCoV 表面抗原的特异性检测。在此基础上，Torrente-Rodrguez 等22则构建了一种可以实现 2019-nCoV N 蛋白、S1 蛋白特异性抗体和 C 反应蛋白多重检测的无线远程医疗电化学生物传感平台。该平台使用激光雕刻的石墨烯，可大规模制备，成本低廉，可实现COVID-19患者血液和唾液样本中3种物质的同时检测。因而，该传感器在远程医疗护理和即时疫情监控方面具有很大的应用潜力。随后，基于 CNT 和过渡金属二硫属

17、化物的 FET 生物传感器也被陆续报道可用于高灵敏的 2019-nCoV 检测。Shao 等23在 Seo 等21工作的基础上分别制备了2019-nCoV S 蛋白抗体和核衣壳蛋白（N 蛋白）抗体功能化的单壁 CNT-FET 生物传感器以用于 2019-nCoV 直接检测。该传感器的检测机制同 Seo 等21的工作类似。该平台检测S 蛋白和 N 蛋白的灵敏度分别为 0.55 fg/ml、0.016 fg/ml，检测速度快（约 5 min）、特异性好。该传感器还可有效用于 38 份临床样本的直接检测，检测阳性率高达约 82%（S 蛋白）。Fathi-Hafshejani 等24则报道了一种 20

18、19-nCoV S 蛋白抗体功能化的二硒化钨（WSe2）FET 生物传感器。该传感器的灵敏度可达 2.5104 fg/ml。除此之外，基于 DNA纳米材料的生物传感器也被报道可用于 2019-nCoV 的直接检测。Zhang 等25制备了一种基于滚环扩增反应的 G-四链体/血红素 DNA 酶化学发光免疫分析系统以用于 2019-nCoV N蛋白检测，该平台的灵敏度为 6.46 fg/ml，血清回收实验中的回收率可达 80.0%91.4%，在 COVID-19 的早期筛查和快速诊断方面具有良好的应用价值。以上基于 2019-nCoV 抗原检测的纳米生物传感器之间的比较见表 2。绝大多数基于201

19、9-nCoV 抗原检测的纳米生物传感器的检测限在 fg/ml 级别，检测时间短，可用于直接临床样本中的 2019-nCoV。相比 2019-nCoV 核酸检测生物传感器，2019-nCoV 抗原检测生物传感器设计更为简单，成本更为低廉，且无需病毒核酸提取与扩增，因而有效缩短了检测周期，在 COVID-19 即时诊断方面具有良好的应用前景。三、展望 本综述介绍了纳米生物传感器的检测原理和分类，着重讨论了其近一年来在 2019-nCoV 检测方面的应用进展，包括2019-nCoV 核酸和表面抗原的特异性检测。基于 2019-nCoV核酸检测的纳米生物传感器表现出免扩增、检测时间短等优点；基于 20

20、19-nCoV 表面抗原检测的纳米生物传感器则具有免标记、无需病毒核酸提取与扩增，可实现直接、快速检测2019-nCoV 的优势。随着纳米生物传感器的日益发展，相信其将会在疾病诊断、疫情防控等方面发挥越来越重要的作用。另一方面，纳米生物传感器也面临着前所未有的挑战，例如：（1）传感器表面固定的生物材料在复杂临床样本体系中易失活，因而容易导致传感器重现性差等问题；（2）一些纳米生物传感器的制备需要复杂的微加工技术，制备成本高、难以实现高通量、微型化检测应用于临床大样本筛查；（3）实际临床样本成分复杂，因而检测临床样本时往往会出现信号不稳定、背景信号高、选择性差等问题。同时，受限于样本来源（如上呼

21、吸道标本和下呼吸道标本中 2019-nCoV 病毒载量不同）和自身检测性能（如灵敏度不高或特异性欠佳）的约束，容易造成假阳性（误诊）和假阴性（漏检）的情况。未来纳米生物传感器可能突破以上瓶颈的几个方向包括：（1）通过技术创新发掘全新的传感器制备工艺及对生物活性材料有稳定作用的介质，使得成本低廉、高度均一、稳定性好、能实现高通量、微型化检测的纳米生物传感器的制备成为可能。（2）增加功能化纳米生物传感器检测临床样本时降低背景信号（降噪）和提高特异性信号（升信）的新方法研究，使纳米生物传感器的灵敏度、特异性等性能指标均能满足实际临床应用的需求，进而早日真正走向临床，引领技术革新，给广大患者带来新时代的福音。