纳米羟基磷灰石_聚氨基酸复合材料生物安全性评价.pdf

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1、论著文章编号:1000?5404(2010)21?2294?06纳米羟基磷灰石/聚氨基酸复合材料生物安全性评价代震宇1,李?军1,赵增辉1,敖晓晓2,蒋电明1?(400016重庆,重庆医科大学附属第一医院骨科1,400014重庆,重庆医科大学附属儿童医院重症监护室2)?摘要?目的?初步评价新型骨修复材料纳米羟基磷灰石/聚氨基酸(nano?hydroxyapatite and poly?a m ino acid,n?HA/PAA)的生物安全性。方法?按照 ISO10993?1标准中规定以自制 n?HA/PAA 为实验组进行以下实验:?体外细胞毒性实验:采用 L929成纤维细胞,完全培养基为阴性对

2、照,苯酚为阳性对照,通过细胞形态学、MTT 试验以及流式细胞进行细胞毒性评价;全身急性毒性实验:以生理盐水为阴性对照组观察 2组小鼠腹腔注射材料浸提液和生理盐水后 72 h内有无中毒和死亡现象;!致敏试验:白化豚鼠 30只均分 3组,以生理盐水为阴性对照组、二硝基氟苯丙酮溶液为阳性对照组观察各组动物致敏区有无红肿和红斑,并记分;溶血实验:生理盐水作为阴性对照组,灭菌蒸馏水为阳性对照组,分别加入抗凝兔血后计算溶血率;#热源实验:新西兰大白兔 3只,按 10 ml/kg注射材料浸提液,测量正常体温与注射后连续3 h内每小时体温的差值;遗传毒性实验:KM 小鼠 30均分 3组,分别按 100 g/k

3、g间隔 24 h注射材料浸提液、环磷酰胺及生理盐水 2次,观察骨髓嗜多染红细胞及含微核小体的骨髓嗜多染红细胞,并计算微核率。结果?体外细胞毒性实验观察材料对细胞形态与生长无明显影响,MTT检测实验组细胞毒性为 1级,流式细胞仪检测材料不会引起细胞凋亡;全身急性毒性实验显示实验组动物无中毒及死亡;致敏试验显示致敏区无水肿及红斑;溶血实验表明材料溶血率为 0.71%,符合小于 5%的实验标准;热源实验显示实验动物无明显体温升高;遗传毒性实验显示材料微核试验阴性,无遗传毒性。结论?n?HA/PAA 复合材料具有良好的生物安全性。?关键词?纳米羟基磷灰石;聚氨基酸;L929;细胞毒性;凋亡;生物安全性

4、?中图法分类号?R318.08;R608?文献标志码?A基金项目?%十一五&国家科技支撑计划(2007BAE13B00);重庆市科委重点攻关项目(CSTC2009AB5080)通信作者?蒋电明,电话:(023)89011212,E?mai:l jd md ian m ingjiang Biological safety of nano?hydroxyapatite and poly?am ino acid compoundDai Zhenyu1,L i Jun1,Zhao Zenghui1,Ao Xiaoxiao2,Jiang Dianm ing1(1Depart ment ofOrthope

5、dics,First AffiliatedHospita,lChongqing M edicalUniversity,Chongqing,400016,2Intensive CareUnit,Children sHospita,l ChongqingM edicalUniversity,Chongqing,400014,China)?Abstract?Objective?To evaluate the biological safety of nano?hydroxyapatite and poly?am ino acid(n?HA/PAA)compound.Methods?A n?HA/PA

6、A compound was prepared according to the ISO10993?1standards to carry out the follow ing experi ments.?In vitro cytotoxicity tes:t L929 fibroblastswere divided intonegative physiological saline group and positive phenol group.Morphologic change was observed and cytotoxicitywas detected byMTT assay a

7、nd flow cytometry.System ic acute toxic tes:tintoxication and deathwere observedin m ice injected w ith a solution of n?HA/PAA compound extraction and physiological saline.!Sensitizationtest:thirty m icewere random ly divided into negative physiological saline group and positive dinitrofluorobenzene

8、group.Edema and erythe m a were observed and scored.H emolytic tes:t m ice were divided into negativephysiological saline group and positive phenol group.H e molytic rate of n?HA/PAA compound was calculatedafter anticoagulant rabbit blood was added.#Pyrogen tes:t 3 rabbits were injected with a solut

9、ion of n?HA/PAA compound extract at the dose of 10 m l/kg.Difference in nor m al body temperature and temperature 3 hafter injection of the solutionwas detected.Genetic toxicity tes:t 30 m ice were random ly divided into threegroups and injectedw ith physiological saline,cyclophospha m ide solution,

10、and solution of n?HA/PAA compoundextrac,t at the dose of 100 g/kg,respectively.Bone marrow polychromatic erythroblasts and polychromaticerythroblasts containing m icronuclei were detected and the m icronuclei rate was counted.Results?In vitrocytotoxicity test showed that n?HA/PAA compound had no obv

11、ious effect on themorphology and grow th of L929fibroblasts.MTT assay revealed that the extract of n?HA/PAA compound could not inhibit the proliferation and2294第 32卷第 21期2010年 11月 15日?第?三?军?医?大?学?学?报ACTA?ACADE M I AE?MEDICI NAE?M ILI TARIS?TERT I AE?Vo.l 32,No.21Nov.15?2010intoxication of L929 fibro

12、blasts.The apoptosis of L929 fibroblasts was not obvious.Syste m ic acute toxic testshowed that n?HA/PAA compound could not cause intox ication and death ofm ice.Sensitization test de monstra?ted no edema and erythema.The hemolytic rate of n?HA/PAA compoundwas0.71%(0.05,与阴性对照组比较;b:P 0.05,与阴性对照组和实验组比

13、较?由表 1可知,苯酚阳性对照组与实验组及阴性对照组 D值各时间点分别比较差异均有显著性(P 0.05),2组细胞毒性分别为 1级和 0级,根据评价标准为 n?HA/PAA复合材料 MTT实验合格。2.1.3?AnnexinV?FI TC/PI双标记流式细胞仪检测结果?各组流式细胞仪散点图结果见图 4。图中可见,实验组与阴性对照组均为大量活细胞集中于左下象限,实验组和阴性对照组各自活细胞分别为(92.76,1.81)%和(93.08,2.71)%。实验组与阴性对照组活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡和坏死细胞数量比较差异无显著性(P 0.05,表 2)。表 2?各组细胞悬浮液流式细胞仪检查结果(%

14、,n=5)组别正常细胞早期凋亡细胞晚期凋亡+坏死细胞实验组92.76,1.81a6.65,2.08a4.16,1.47a阴性对照组93.08,2.716.75,1.824.40,1.57a:P 0.05,与阴性对照组比较2296第 32卷第 21期2010年 11月 15日?第?三?军?医?大?学?学?报ACTA?ACADE M I AE?MEDICI NAE?M ILI TARIS?TERT I AE?Vo.l 32,No.21Nov.15?2010A:苯酚阳性对照组;B:完全培养基阴性对照组;C:材料浸提液实验组图 1?倒置相差显微镜观察各组与 L929共同培养 24 h时细胞形态变化?(

15、+100)A:苯酚阳性对照组;B:完全培养基阴性对照组;C:材料浸提液实验组图 2?倒置相差显微镜观察各组与 L929共同培养 48 h时细胞形态变化?(+100)A:苯酚阳性对照组;B:完全培养基阴性对照组;C:材料浸提液实验组图 3?倒置相差显微镜观察各组与 L929共同培养 96 h时细胞形态变化?(+100)A:阴性对照组;B:材料浸提液实验组图 4?流式细胞仪检测 2组与 L929共同培养 96 h后的结果2.2?全身急性毒性实验结果?观察期内 2组小鼠一般情况良好,未见中毒症状及死亡。注射后 24、48、72 h测量体质量增加值变化见表 3,实验组比较对照组比较差异无显著性(P 0

16、.05)。表 3?全身急性毒性实验小鼠体质量增加值变化(g,n=10)组别24 h48 h72 h对照组0.82,0.211.85,0.412.87,0.42实验组0.80,0.16a1.92,0.31a2.86,0.34aa:P 0.05,与对照组比较2.3?致敏试验结果?弃去敷贴物后,分别于 24、48、72 h观察发现阳性对照组 6只动物 24 h后在激发部位出现红斑,4只出现轻度水肿;48 h出现水肿有所加重并有 1只出现轻度焦痂;72 h红斑进一步加重,呈重度红斑状态。而阴性对照组和实验组动物各时间点皮肤均无红斑和水肿反应,记分为 0。2.4?溶血实验结果?本实验中实验组吸光度为 0

17、.016,阴性对照组吸光度为2297第 32卷第 21期2010年 11月 15日?第?三?军?医?大?学?学?报ACTA?ACADE M I AE?MEDICI NAE?M ILI TARIS?TERT I AE?Vo.l 32,No.21Nov.15?20100 011,阳性对照组为 0.701。材料溶血率为 0.71%,远小于5%,符合溶血实验标准要求。2.5?热源实验结果?3只实验兔的体温升高分别为 0.17、0.2、0.15 ,均在0.5 以下,且 3只兔体温升高总数在 1.5 以下,n?HA/PAA复合材料符合热源实验要求。2.6?遗传毒性实验结果?经骨髓涂片微核计数,实验组与阴性

18、对照组比较,微核率及嗜多染红细胞与正红细胞比例未见明显统计学差异(P 0 05,表 4),n?HA/PAA复合材料骨髓微核实验为阴性,无遗传毒性。表 4?小鼠骨髓微核试验微核率结果(?x,s,n=10)组别嗜多染红细胞数含微核嗜多染红细胞数微核率()嗜多染红细胞数/正红细胞阳性对照组1 000+1015815.80.69,0.08a阴性对照组1 000+10161.61.26,0.32b实验组1 000+10181.81.22,0.28a:P 0.05;阴性对照组与实验组比较3?讨论?体外细胞毒性实验是新型医用材料生物安全性测试中一个很重要的组成部分,它可以了解细胞和受试材料接触后发生的生长抑

19、制、功能改变、溶解、死亡或其他毒性反应,预测受试材料最终体内应用时的组织细胞反应,在短期内较经济、简便的检测出受试材料的细胞毒性。?目前 ISO对材料浸提的时间规定为 24 72 h,通常材料在浸提 24 h后即可以浸提出其所有的有毒或无毒溶出物,至多不超过 72 h,所以本实验中选择浸提时间为 72 h。L929成纤维细胞作为非植入部位的细胞,可以充分反映出材料可能存在的毒性物质的反应,它具有传代稳定、繁殖迅速、易保存、体外培养条件低、对生长环境因素比较敏感等优点,是目前检测材料细胞毒性实验中应用最早及使用最广泛的细胞,也是ISO 10993?5推荐为细胞毒性实验标准中的标准细胞。因此,本实

20、验选用 L929成纤维细胞对新型 n?HA/PAA骨组织修复材料的体外细胞毒性进行评价。?细胞形态学观察可以为材料的细胞相容性提供最直观的证据,当材料在体外与细胞共培养后,一旦材料有毒物质释放,细胞的形态和增殖状态就会立即发生变化 14。本实 验通过 倒置相 差显微 镜观察 发现n?HA/PA 复合材料浸提液与 L929细胞共同培养后96 h内与完全培养基组 L929细胞生长类似,细胞贴壁生长良好,并且随着材料与细胞共同培养时间的增加,L929细胞生长明显,形态正常,初步显示出该材料具有良好的细胞相容性。MTT 比色法由于操作简便、可重复性好而成为检测细胞增殖实验的首选方法,是目前国内外公认且

21、广泛用于量化细胞毒性的评价方法。本实验 MTT 结果发现实验组与阴性对照组在各时间点吸光度值均无明显差异(P 0.05),且随着培养时间增加,2组细胞均增殖明显,RGR分别为 1或 0级,细胞毒性评定结果均为合格。在材料与细胞的共同培养过程中,细胞凋亡的发生通常与材料的性质或构成密切相关。对细胞凋亡的分析有助于了解组织与材料的相 互作用,从而 评估材料的 生物学性 能。AnnexinV?FI TC/PI双标记是检测细胞膜成分变化的一种流式细胞仪检测法,是目前评价生物材料细胞毒性实验中较为理想的检测细胞凋亡法 15。由本实验散点图观察发现,实验组和阴性对照组显示大量的细胞集中于左下象限,说明 2

22、组细胞凋亡发生少,而正常细胞含量高,提示细胞的生长状态良好。分别比较两组之间活细胞、早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞的含量,亦未见明显统计学差异(P 0.05)。因此可见同阴性对照组细胞完全培养基下生长环境结果类似,n?HA/PA复合材料不会促进细胞的凋亡。?n?HA/PAA复合材料的最终目的是作为体内植入物应用于临床。因此,除上述体外细胞毒性评价以外,本研究又选用全身急性毒性实验、致敏实验、溶血实验以及热源实验对该复合材料的生物安全性检测进行补充评价。在本实验中,n?HA/PAA复合材料浸提液注射入实验动物体内 72 h内无任何中毒和死亡现象,体温无明显升高,致敏试验未出现皮肤红肿和红斑,且对血

23、液溶血率仅为 0.71%,远低于 5%的标准要求。另外,成功的骨组织修复植入材料在体内存留至少数月,长则可达数年甚至数十年,所以分析检测材料潜在的遗传毒性、致癌性和生殖毒性等危害也是十分必要的。然而,对这一系列实验开展完全检测大多耗时耗资巨大,普及开展这些检测项目并不符合我国国情。同时,与生物安全性评价标准的其他项目相比,遗传毒性、致癌性和生殖毒性的评价方法并不完善,对组织工程支架材料进行检验的有效性也未得到很好的确认。因此,我们选用 ISO标准中推荐的短期遗传毒性实验做初步筛选,如短期遗传毒性实验阳性者则考虑进行致癌实验,如为阴性者可暂不进行之。本实验短期的骨髓微核试验证实了 n?HA/PA

24、A 复合材料同生理盐水结果一致,不会引起微核增加,无潜在的遗传毒性,故未再增加致癌实验和生殖毒性实验检测。?综上,本实验依据 ISO 10993标准要求,结合体内外常用的生物安全性检测指标对自制材料进行了初步的综合评价,结果证实该复合材料体内外实验均在安2298第 32卷第 21期2010年 11月 15日?第?三?军?医?大?学?学?报ACTA?ACADE M I AE?MEDICI NAE?M ILI TARIS?TERT I AE?Vo.l 32,No.21Nov.15?2010全范围内,体内实验符合体外实验结果。表明该新型n?HA/PAA复合材料具有良好的生物安全性能,从而为材料的后期

25、功能研究及临床应用提供了科学依据。参考文献:1 Gentile P,Chiono V,BoccafoschiF,et al.Composite fil ms of gelatinand hydroxyapatite/bioactive glass for tissue?engineering applications J.J BiomaterSciPolym Ed,2010,21(8/9):1207-1226.2 Roohani?Esfahani S I,Nouri?Khorasani S,Lu Z,et al.The influencehydroxyapatite nanoparticle

26、shape and size on the properties of biphasiccalcium phosphate scaffolds coated w ith hydroxyapatite?PCL composites J.Biomaterials,2010,31(21):5498-5509.3 K i m S S,Sun?Park M,Jeon O,et al.Poly(lactide?co?g lycolide)/hydroxyapatite composite scaffo lds forbone tissue engineering J.B io?materials,2006

27、,27(8):1399-1409.4 赵建华,廖建宏,刘鹏,等.消旋聚乳酸/羟基磷灰石/脱钙骨基质人工骨修复兔桡骨大段骨缺损的实验研究 J.第三军医大学学报,2003,25(21):1943-1946.5 梁勇,蒋电明.纳米羟基磷灰石/聚酰胺 66椎间融合器对山羊颈椎的融合效果研究 J.第三军医大学学报,2007,29(24):2333-2335.6 Ye X,ChenM,Y angM,et al.In vitro corrosion resistance and cyto?compatibility of nano?hydroxyapatite reinforced M g?Zn?Zr co

28、mposites J.JM aterSciM aterM ed,2010,21(4):1321-1328.7 M atsumura Y.Po ly(am ino acid)micelle nanocarriers in preclinicaland clinical studies J.Adv Drug Deliv Rev,2008,60(8):899-914.8 严永刚,李鸿,吕国玉,等.聚合物形式的组织修复材料及制备方法:中国,CN101342383 P.2009-01-14.9 严永刚,李鸿,吕国玉,等.多组分氨基酸聚合物形式的组织修复材料及制备方法:中国,CN101385869 P.2

29、009-03-18.10 郝和平.医疗器械生物学评价标准实施指南 M.北京:中国标准出社,2002:100-110.11 裴国献,魏宽海,金丹.组织工程学实验技术 M.北京:人民军医出版社,2006:177-178.12 裴国献,魏宽海,金丹.组织工程学实验技术 M.北京:人民军医出版社,2006:180.13 孙立魁,施燕平,黄经春,等.用微核试验评价生物羊膜遗传毒性的研究 J.中国医疗器械信息,2008,14(11):31-33.14 Rizzi S C,Heath D J,CoombesA G,et al.Biodegradable polymer/hydroxyapatite comp

30、osites:surface analysis and initial attachment ofhuman osteoblasts J.J BiomedM ater Res,2001,55(4):475-486.15 雷晓,余佩武.双标记流式细胞术定量分析 5?FU 诱导胃癌细胞早期凋亡 J.第三军医大学学报,2002,24(7):855-857.(收稿:2010?06?21;修回:2010?07?14)(编辑?王?红)?(上接 2285页)1.3?统计学处理?应用 SPSS 11.5软件进行统计,计数资料采用 2检验。2?结果?治疗组 56耳:痊愈 9耳(16.1%);显效 17耳(30.

31、4%);有效 8耳(14.3%);总有效 34耳(60.8%);无效 22耳(39.2%)。对照组 96耳:痊愈 2耳(2.1%);显效 15耳(15.6%);有效 22耳(22.9%);总有效 39耳(40.6%);无效 57耳(59.4%)。2组总有效率比较差异有统计学意义(2=5.72,P 0.05)。3?讨论?耳鸣是一种听觉紊乱现象,由听觉传导通路的任一环节异常放电引起 2。主观性耳鸣主要与内耳及大脑皮层有关。研究表明,耳蜗的损伤可以引起耳鸣。耳鸣多采用综合治疗:包括病因治疗、药物治疗、习服疗法、掩蔽疗法、心理治疗、电刺激治疗等。而药物治疗主要以改善内耳的微循环、营养耳神经为主。?地塞

32、米松具有抑制炎症反应和神经保护作用,全身大剂量用药存在禁忌证并产生很多副作用,我们经外耳道中耳鼓膜穿刺途径直接用药到内耳。动物实验 3证实:地塞米松经鼓室给药能有效的经圆窗膜渗透到外淋巴液,外淋巴液中的药物浓度明显高于全身给药血浆中的浓度,且不对豚鼠耳蜗结构和功能产生影响 4。我们对治疗组 56耳在常规口服药物治疗的基础上加用中耳灌注地塞米松治疗。中耳灌注地塞米松后,地塞米松直接通过圆窗膜作用于内耳,在内耳体液中达到较高浓度,并与内耳的激素受体结合,发挥其抑制炎症反应和神经保护作用,调节内耳的电解质平衡和淋巴液稳定,从而达到改善耳鸣的作用。56耳总有效率为 60.8%,明显高于对照组总有效率4

33、0.6%,明显提高了治疗效果。?采用经鼓膜穿刺将地塞米松注入中耳,无需特殊设备,门诊即可完成,操作简单。中耳注入地塞米松,不经过全身代谢,从而避免全身副作用,用药安全。与心理治疗,各种声信息等治疗比较,费用低廉。经鼓膜穿刺中耳注药 56耳除 1例发生一过性眩晕外,无其他不良反应。?综上所述,中耳灌注地塞米松能有效提高主观性耳鸣的治疗效果,且具有简单、安全、费用低等优点。参考文献:1 王洪田,李明,刘蓬,等.耳鸣的诊断和治疗指南(建议案)J.中华耳科学杂志,2009,7(3):185.2 薛飞,李泽卿,王秋萍.耳鸣诊断与治疗的研究进展 J.中华实用诊断与治疗杂志,2009,23(7):630-6

34、31.3 吴皓,杨军,侯东明,等.地塞米松圆窗和全身给药后在豚鼠外淋巴液及血浆中的代谢动力学特征 J.听力及言语疾病杂志,2005,13(4):260-263.4 刘建宏,董明敏,迟放鲁.地塞米松经鼓室给药对豚鼠耳蜗结构和功能的影响 J.中华耳鼻咽喉头颈外科杂,2005,40(6):440-443.(收稿:2010?07?14;修回:2010?07?31)(编辑?吴培红)2299第 32卷第 21期2010年 11月 15日?第?三?军?医?大?学?学?报ACTA?ACADE M I AE?MEDICI NAE?M ILI TARIS?TERT I AE?Vo.l 32,No.21Nov.15?2010