第六章常用分子生物学技术RNA干扰技术.ppt

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1、生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）以以生生物物、电电子子、机机械械和和信信息息技技术术为为基基础础，在在固固相相支支持持物物表表面面建建立立集集成成、连连续续、微微型型分分析析系系统统，形形成成芯芯片片，实实现现对对生生物物大大分分子子的准确、快速、高通量、自动化检测。的准确、快速、高通量、自动化检测。基因芯片（基因芯片（gene chip）将将大大量量探探针针有有序序排排列列于于固固相相支支持持物物表表面面或或直直接接在在固固相相支支持持物物上上原原位位合合成成探探针针，然然后后与与标标记记的的待待测测核核酸酸样样品品进进行行杂杂交交，通通过过对对探探针针杂杂交交信信号号强强

2、度度的的分分析析来来获获知知样品中相应靶分子的数量和序列信息。样品中相应靶分子的数量和序列信息。基因芯片基因芯片工作原理工作原理：核酸分子杂交：核酸分子杂交1.1.芯片的制备芯片的制备 基因芯片检测步骤：基因芯片检测步骤：2.2.样品准备和标记样品准备和标记3.3.分子杂交分子杂交4.4.信号检测信号检测5.5.数据处理分析数据处理分析蛋白质芯片蛋白质芯片 （protein chip）将将蛋蛋白白质质有有序序固固定定于于载载体体上上制制备备芯芯片片，然然后后用用标标记记的的蛋蛋白白质质或或其其他他成成分分与与芯芯片片作作用用，洗洗去去未未结结合合的的成成分分，再再检检测测芯芯片片上上的的荧荧光

3、光强强度度，来来分分析析蛋蛋白白质质间间或或蛋蛋白白质质与与其其他他分分子之间的相互作用关系。子之间的相互作用关系。将将不不同同生生物物体体组组织织标标本本按按预预先先设设计计的的顺顺序序排排列列在在固固相相载载体体上上形形成成的的组组织织微微阵阵列列，是是一一种种高高通通量量、多多样样本本的分析工具。的分析工具。组织芯片组织芯片（tissue microarray）用用人人工工方方法法测测定定并并分分析析核核酸酸的的碱碱基基组组成成及及排排列列顺序顺序，即，即测定核酸的一级结构测定核酸的一级结构。第一代测序技术：第一代测序技术：链末端终止法链末端终止法 (Sanger法，双脱氧链终止法法，双

4、脱氧链终止法)核酸测序核酸测序（sequencing of nucleic acids）双脱氧链终止法双脱氧链终止法测序测序n以以待待测测单单链链DNA为为模模板板，以以dNTP为为底底物物，在在测测序序引引物引导下，物引导下，DNA聚合酶聚合酶介导介导体外合成互补体外合成互补DNA。n双双 脱脱 氧氧 核核 苷苷 三三 磷磷 酸酸（dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP）为为链链终终止止子子（4组组1套套反反应应），合成四组有序列梯度的互补合成四组有序列梯度的互补DNA。n高高分分辨辨电电泳泳分分离离新新合合成成DNA，根根据据产产物物大大小小识识读

5、读碱碱基基排列顺序，最终转换为待测模板的核酸序列。排列顺序，最终转换为待测模板的核酸序列。基本原理基本原理双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP)测测序序模模板板序序列列5TCAGCTCGAATC第六章第六章 常用分子生物学技术常用分子生物学技术第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应第二节第二节 分子杂交技术分子杂交技术第三节第三节 基因敲除技术基因敲除技术第四节第四节 RNARNA干扰技术干扰技术第五节第五节 基因组编辑技术基因组编辑技术第六节第六节 分子相互作用技术分子相互作用技术RNA干扰技术干扰技术 双双链链R

6、NARNA能能高高效效、特特异异性性地地诱诱导导同同源源mRNAmRNA降降解解，从从而而沉沉默默基基因因表表达达，称称为为RNARNA干干扰扰（RNA interference,RNAi），也也称称转转录录后后基因沉默。基因沉默。1990年，在转基因牵牛花中观察到共抑制现象年，在转基因牵牛花中观察到共抑制现象RNA干扰干扰（RNA interference,RNAi）1998年年，Andrew Fire和和Craig Melo首首次次将将正正义义链链和和反反义义链链RNA混混合合后后，注注入入线线虫虫（C.elegans），观观察察到到更更强强的的基基因因表表达达抑抑制制作作用用，据此提出据

7、此提出RNA干扰的概念。干扰的概念。A.未染色组未染色组;B.正常对照组正常对照组C.反义反义RNA组组;D.正义正义+反义反义RNA组组 2001年年，首首次次报报道道在在哺哺乳乳动动物物细细胞胞中中，通通过过21 个核苷酸大小的个核苷酸大小的siRNA诱导特异性基因沉默。诱导特异性基因沉默。安德鲁安德鲁菲尔菲尔&克雷格克雷格梅洛梅洛发现发现“RNA干扰机制干扰机制”，获，获2006年诺贝尔医学奖年诺贝尔医学奖RNA干扰的机制干扰的机制（1）siRNA形形成成：dsRNA被被Dicer酶酶剪剪切切成成小小干干扰扰RNA（small interfering RNA，siRNA）（2）RNA诱诱

8、 导导 的的 沉沉 默默 复复 合合 物物（RNA-induced silencing complex，RISC）形成）形成（3）RISC 活活化化：siRNA解解旋旋成成为为单单链链，无无活活性性的的RISC转变成活性形式（包含转变成活性形式（包含siRNA反义链）反义链）（4）诱诱导导靶靶mRNA降降解解：在在siRNA反反义义链链引引导导下下，RISC识别并切割与识别并切割与siRNA反义链反义链互补的靶互补的靶mRNA（5）dsRNA的再生成的再生成RNA干扰的机制干扰的机制 siRNA（小小干干扰扰RNA）：21-23nt，由由dsRNA裂裂解解而而成成的的小小片片段段，可可诱诱导导

9、mRNA降降解解。siRNA主要参与抵御外源性病毒核酸的侵染。主要参与抵御外源性病毒核酸的侵染。RNA干扰干扰（RNA interference,RNAi）miRNA（微微小小RNA）：约约22nt，由由miRNA前前体体剪剪切切而而成成，可可抑抑制制mRNA翻翻译译。miRNA主主要参与内源性基因表达调节。要参与内源性基因表达调节。siRNA(小干扰小干扰RNA)miRNA(微小微小RNA)来源来源siRNA是外源性的，是外源性的，是是RNA干扰的中间产物干扰的中间产物miRNA是内源性的，是内源性的，是生物体固有是生物体固有结构结构siRNA是双链是双链RNAmiRNA是单链是单链RNAD

10、icer酶酶加工过程加工过程对称地来源于双链对称地来源于双链RNA不对称加工，仅剪切不对称加工，仅剪切miRNA的侧臂的侧臂作用位置作用位置siRNA可作用于可作用于mRNA的的任何部位任何部位miRNA主要作用于主要作用于mRNA 3端非翻译区（端非翻译区（3-UTR）作用方式作用方式siRNA一般导致靶一般导致靶mRNA的降解，即为转录水平后的降解，即为转录水平后调控。调控。miRNA可抑制靶可抑制靶mRNA的的翻译，也可以导致靶翻译，也可以导致靶mRNA降解，即在转录后水平和翻降解，即在转录后水平和翻译水平起作用译水平起作用作用阶段作用阶段siRNA不参与生物生长，不参与生物生长，主要作

11、用是抑制病毒感染主要作用是抑制病毒感染miRNA主要调节内源基因主要调节内源基因表达，在发育过程中起作用表达，在发育过程中起作用RNA干扰技术干扰技术实施策略实施策略1、体外合成、体外合成siRNA采采用用化化学学合合成成法法来来直直接接合合成成靶靶向向目目的的基基因因的的siRNA，再通过不同方法导入细胞。，再通过不同方法导入细胞。2、siRNA表达载体介导表达载体介导根根据据siRNA序序列列设设计计DNA片片段段，插插入入表表达达载载体体中中，导导入入细细胞胞，转转录录出出shRNA，进进一一步步切切割割形形成成siRNA。体外合成体外合成siRNA短发卡短发卡RNA（shRNA）siR

12、NA表达载体介导表达载体介导正义链正义链反义链反义链-CUGAGGUCACCAUUAGAUG-靶靶mRNARNA干扰技术干扰技术特点特点1、RNA干扰技术干扰技术优点优点（1）具有较高特异性）具有较高特异性（2）基因沉默效率较高）基因沉默效率较高2、RNA干扰技术干扰技术缺点缺点 “脱靶效应脱靶效应”（off-target effects）RNA干扰技术的应用干扰技术的应用2、基因治疗、基因治疗（基因失活性治疗）（基因失活性治疗）（1）病毒感染性疾病）病毒感染性疾病 通过通过RNAi抑制抑制 RNA病毒复制病毒复制1、基因功能研究、基因功能研究（功能失活策略功能失活策略）（2）基因过表达引起的

13、疾病）基因过表达引起的疾病（如肿瘤）（如肿瘤）siRNA药物药物“基因敲减（基因敲减（knockdown）”基因打靶基因打靶（gene targeting）利用利用同源重组原理同源重组原理对细胞特定对细胞特定内源基因内源基因进进行改造的技术。行改造的技术。基因敲除（基因敲除（gene knockout）：）：宿主基因组宿主基因组中特定中特定功能基因功能基因的部分片段被的部分片段被同源的外源同源的外源DNA片段替代片段替代，从而使，从而使靶基因失活靶基因失活。基因敲入（基因敲入（gene knockin）：）：外源功能基因外源功能基因与宿主与宿主基因组中的同源序列基因组中的同源序列进行同源重组，

14、进行同源重组，插入到基因组中，从而在细胞内获得表达。插入到基因组中，从而在细胞内获得表达。基因打靶基因打靶（gene targeting）基因敲除小鼠的产生基因敲除小鼠的产生1.体体外外构构建建基基因因敲敲除除载载体体：靶靶基基因因同同源源DNA序序列列+选选择择性性标标记基因记基因2.将将基基因因敲敲除除载载体体导导入入ES细细胞胞：显微注射法、电穿孔法等显微注射法、电穿孔法等3.筛筛选选、鉴鉴定定发发生生了了同同源源重重组组的的ES细细胞胞：标标记记筛筛选选法法、分分子子鉴定法鉴定法4.将将ES细细胞胞导导入入胚胚胎胎，胚胚胎胎植植入假孕雌鼠的子宫入假孕雌鼠的子宫5.小小鼠鼠交交配配传传代

15、代获获得得特特定定的的纯纯合合基因型子代小鼠基因型子代小鼠Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠（基因敲除小鼠比野生型小鼠（WT）出现明显体重增加现象出现明显体重增加现象REG基因敲除鼠（下图）出现脊椎弯曲等早衰现象基因敲除鼠（下图）出现脊椎弯曲等早衰现象Gab1Gab1基因敲除导致小鼠缺血性血管新生、侧枝循环建立出现缺基因敲除导致小鼠缺血性血管新生、侧枝循环建立出现缺陷（图示上半部分），主要是由于血管内皮细胞管状结构形成陷（图示上半部分），主要是由于血管内皮细胞管状结构形成的信号调控通路出现障碍而引起的（图示下半部分）。的信号调控通路出现障碍而引起的（图示下半部分）。酪氨酸酶酪氨酸酶基因敲除后，

16、本来是黑色的小猪，基因敲除后，本来是黑色的小猪，变成了白色，表现出典型的白化病特征。变成了白色，表现出典型的白化病特征。基因编辑基因编辑（gene editing）对目标基因进行对目标基因进行“编辑编辑”，实现对特，实现对特定定DNA片段的敲除、加入等。片段的敲除、加入等。CRISPR/Cas系统系统：由：由CRISPR基因座基因座与其串联的与其串联的Cas基因组成，通过序列特异基因组成，通过序列特异的的RNA介导，切割降解介导，切割降解DNA。Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/Cas9CRISPRCRISPR：成簇规律间隔性短回文重复序列：成簇规律间隔性短回文重复序列CasCas：CRISPRCRISPR相关基因相关基因RNA干扰（干扰（RNAi)siRNA、miRNARNA干扰技术策略、应用干扰技术策略、应用基因敲除基因敲除基因编辑基因编辑常用分子生物学技术：常用分子生物学技术：RNA干扰、基因敲除干扰、基因敲除小结小结作作 业业 比比较较RNA干干扰扰与与基基因因敲敲除除的的异异同同点点，简简述述它它们们在在药药学学中的应用。中的应用。