36ZnO_活性碳复合材料抗菌性能及安全性研究.pdf

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1、 研究报告生物技术通报B IOTECHNOLOGYBULLETIN2010年第1期载ZnO/活性碳复合材料抗菌性能及安全性研究韩绪军1张立波2冯悦1唐颖蕾1魏大巧1彭金辉2夏雪山1(1昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明650224;2昆明理工大学材料与冶金工程学院,昆明650093)摘 要:废催化剂微波烧结法制备的ZnO/活性碳复合材料,在多孔活性炭表面附载有ZnO,是一种新型的环保材料。为评价其抗菌活性和使用安全性,本研究进行了材料对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及酵母菌的抑菌试验,结果表明ZnO/活性碳复合材料有很好的抑制细菌增殖效果,低浓度下(011g/mL)作用2 h的抑菌率

2、能达到90%以上,对真菌-酵母菌的抑制活性相对较低;经细胞毒性试验、动物口服急性毒性试验,皮肤过敏性试验发现,材料对小鼠经口灌喂半致死剂量(LD50)2 000 mg/kg,对兔皮肤刺激性积分为0,对细胞生长无影响,属于实际生物无毒级。试验结果表明ZnO/活性碳复合材料具有很好的抗菌效果及使用安全性。关键词:ZnO 活性碳抗菌作用抑菌率生物安全性Evaluation on Antibacterial Affects and Bio2safety ofZnO/active Carbon CompositeMaterialHan Xujun1Zhang Libo2Feng Yue1Tang Yin

3、glei1WeiDaqiao1Peng Jinhui2Xia Xueshan1(1Faculty of Life Science and Technology,Kunm ing University of Science and Technology,Kunm ing650224;2Faculty of Material and Metallurgical Engineering,Kunm ing University of Science and Technology,Kunm ing650093)Abstract:As a novel environmental protection ma

4、terial,the ZnO/active carbon composite material is prepared with microwavesinteringmethods from deserted catalyst,which carry ZnO in its plentiful holes1To evaluate its antibacterial affects and bio2safety,theexperiment of anti2bacteria and anti2fungiwas conducted1The results showed thatmore than 90

5、%bacteria were inactivated whenEsch2erichia coli,Staphylococcus aureausandB1subtiliswere incubated at37for t wo hours togetherwithmaterial1In comparison,its effecton yeast is low1The cultured cell toxicity,animal oral acute toxicity and skin allergy tests were also perfor med1According the itseffect

6、s,the oralLD50of the material formice wasmore than 2 000 mg/kg,its stimulating score on the rabbit skin was zero,and thecells can grew normally,which suggested its high bio2safety1These findings indicate this ZnO/active carbon composite material has agood anti2bacterial affects and could be used bio

7、2safely1Key words:ZnOActivated carbonAntibacterial effectRate of antibacteriaBiosafety收稿日期:2009211202基金项目:云南省科技厅国际合作项目(2006GH01),科技部国际合作项目(2008DFA91500)作者简介:韩绪军,男,硕士研究生,研究方向:生物化工专业;E2mail:hanxujun43181631com通讯作者:夏雪山,博士,副教授,主要从事病原生物学及抗菌材料生物功能方面的研究;E2mail:oliverxia2000yahoo1com1cn随着社会发展及人民生活水平的提高,健康的生

8、存环境日益成为人类的追求目标,人们在利用微生物有益性的同时,也十分警惕其作为病原菌的危害性。利用抗菌材料及其制品抗菌、杀菌是净化环境保障健康的有效措施1。近年来,具有抗菌活性的无机抗菌材料因其安全性稳定性应用越来越广2-4。将具有杀菌能力的金属或金属氧化物负载于性能稳定的无机材料上制备的复合材料,是无机抗菌剂主要类型。氧化锌是最早用于抗菌的金属氧化物之一,据认为可通过接触反应和光催化产生活性氧两种方式起到杀菌作用5,同时具有良好生物相容性、环境协调性和使用安全性6。ZnO的主要抗菌活性分子是颗粒表面能产生的过氧化氢(H2O2)7,8,要求与被作用菌体近2010年第1期韩绪军等:载ZnO/活性碳

9、复合材料抗菌性能及安全性研究距离接触而发挥抗菌活性9,ZnO最佳的抗菌pH值范围在7-8之间10。氧化锌超细粉 11 及四针状氧化锌12 对多种病原菌的抑制作用及其安全性已被有效证实。目前无机抗菌材料用载体多是一些多孔材料如沸石,硅胶,活性碳等。活性碳性质稳定,耐高温,比表面积大,微孔丰富,对各种无机和有机气体,水溶液中的有机物,贵重金属离子等有较大的吸附量和较快的吸附速率,并且可以再生。同时,活性碳对微生物也有很好的吸附作用13,能够将大量的微生物(细菌)吸附在活性碳材料表面。若将具有抗菌活性金属氧化物负载在活性碳载上,将可能使这种复合材料具有吸附和抗菌双重功能。本研究在利用化工废催化剂微波

10、烧结法制备获得载氧化锌活性炭复合材料,主要进行了材料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌的抑制/杀灭作用试验,以确定其抗菌活性,并通过细胞毒性试验、小鼠口服急性毒性试验和白兔皮肤刺激性试验评价其使用安全性。1 材料和方法111 材料ZnO/活性碳复合材料(1#-10#)由昆明理工大学高校微波冶金重点实验室制备。受试菌和细胞:大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球(Staphy2lococcus aureaus)、枯草芽孢杆菌(B acillus subtilis)及酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiaeHansen)、HepG2细胞株,为本

11、实验室保存。清洁级昆明小鼠体重202 g,26只,雌雄各半;普通级新西兰白兔4只,体重2012 kg,雌雄各半。从昆明医学院实验动物中心购买。112 方法11211 材料浸泡接触杀菌试验将受试菌按照在各自生长适宜条件下制备好的菌悬液,控制菌液浓度为105-107CFU/mL,分装50 mL的三角瓶,每瓶各20 mL菌悬液,分别加入预先灭好菌的1#-10#号ZnO/活性碳复合材料样品各1 g,同时设不加材料的阴性对照。37、150 r/min的摇床处理2 h后,采用梯度稀释平板菌落计数法计算菌悬液中活菌数。根据处理后菌悬液活菌数的差异,计算出材料的杀菌率。在上述试验的基础上,选取5#材料对以上几

12、种受试菌进一步试验,20 mL的培养液内,加入不同量5#ZnO/活性碳复合材料,使其终浓度呈现梯度分布,同样条件处理受试菌,测定其不同材料浓度条件下的抑菌情况,绘制量效曲线,分析确定5#材料对各受试菌的最小抑菌浓度。11212 细胞毒性试验称取0125 g复合材料(1#-10#),高压湿热灭菌,干燥后,加入10 mL MEM完全培养基,37oC浸提36 h,离心取上清为原始材料浸提液。复苏肝癌细胞系HepG2,MEM培养基生长至对数生长期,消化传代,接种96孔板,铺板密度为105/孔。24 h后待细胞贴壁长好,加入原始材料浸提液,同时设置活性炭粉浸提液处理细胞和只有浸提液的无细胞对照孔。继续培

13、养24 h后,MTT法测定细胞成活率。按公式:细胞生长抑制率(%)=(1-试验孔OD值/对照孔OD值)100,评价材料的细胞毒性14。选取5#材料,用MEM培养基配制的不同浓度梯度的浸提液,同样条件处理细胞,评价不同浓度材料浸提液的细胞毒性。11213 口服急性毒性试验26只健康昆明小鼠,体重202 g。在动物房环境中适应3 d,试验前禁食(不限制饮水)16 h。将选取的3#、5#材料用PBS制成012 g/mL的ZnO/活性碳复合材料(研磨后)悬液,按011 mL/10 g(体重)计算灌喂剂量,采用一次经口灌胃后,继续禁食3 h,在恢复正常供水、供食。两种材料剂量灌喂小鼠的数量均为10只,雌

14、雄各半;同时设仅灌喂无材料PBS的空白对照组(6只),两周内观察动物的中毒症状和死亡情况,计算其LD50。11214 急性皮肤刺激试验将约2 kg重的新西兰大耳白兔背部脊柱两侧被毛剪掉,不损伤表皮,去毛范围约3 cm3 cm。用凡士林与3#、5#材料11 g,15 g调成均匀糊状,取1 g涂于215 cm215 cm 4层纱布上,马上敷贴在白兔一侧的去毛皮肤上,再用无刺激性胶布加以固定。另一侧敷用凡士林作为对照。敷用24 h后用温水除去残留物,于试验后24 h和48 h观察涂抹部位皮肤反应,按表1进行皮肤刺激反应积分,积分低于014为无刺激性(表1)。102生物技术通报B iotechnolo

15、gyBulletin2010年第1期表1皮肤刺激强度积分红斑形成积分水肿形成积分无红斑勉强可见明显红斑中等-严重红斑紫红色红斑并有焦痂形成01234无水肿勉强可见皮肤隆起轮廓清楚水肿隆起约1 mm水肿隆起超过1 mm,范围扩大012342 结果211 抑菌试验结果试验条件下,ZnO/活性碳复合材料对原核细菌能起到很好的杀灭作用,无论对革兰氏阴性的大肠杆菌,还是革兰氏阳性金黄色葡萄球菌,以及能产生芽孢的枯草芽孢杆菌,都有明显的抑菌效果(表2)。20 mL菌悬液中加入1 g复合材料(1#-10#)对3种细菌的生长抑制率均高达99%。材料对真菌 酿酒酵母的抑菌效果相比较细菌来说要差,抑菌率从2819

16、1%(10#)至64134%(6#)不等。对5#材料进行了5,2 系列稀释,不同浓度材料抑菌试验发现,011g/mL以上浓度的材料有明显的抑菌效果,对3种细菌的抑菌率分别为大肠杆菌94189%、金黄色葡萄球菌92103%、枯草芽孢杆菌94199%。011-50g/mL的之间的6个受试材料浓度,抑菌效果稳定,浓度/抑菌率曲线的斜率趋近与零,说明011g/mL的5#材料悬液就可达到明显的抑菌效果。在低浓度情况下,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌似乎对该材料更敏感,在低的浓度(010125g/mL)抑菌率仍约80%,但此浓度大肠杆菌下就能达到71%的抗菌效果(图1)。材料对真核细胞 酵母菌的增殖也有一定

17、的抑制作用,011g/mL的5#材料混悬液就达到最高抑制率(-60%),说明酵母菌对该材料具有很好的耐受性。表2 复合材料抑菌率材料抑菌率(%)大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌酿酒酵母1#991709919999199541972#991999919999199361373#991999919999199521254#991959919999198831415#991839919999198641226#991729919999198641347#991999917699197541748#931609915399197621689#9919799147991955319110#771289

18、81349918928191212 细胞毒性试验结果根据处理细胞经MTT法测定、数据分析结果,炭粉浸提液对HepG2细胞生长抑制率为23144%,而1#-10#材料浸提液对细胞生长抑制率为15%-25%之间,对细胞生长所有材料浸提液无明显影响。0125 g的5#材料/10 mL MEM完全培养基浸提液处理细胞,对细胞生长的抑制率为16106%,该浸提液经2 系列稀释(6个稀释度)处理细胞,未发现对细胞明显的毒害作用,材料浸提液对受试细胞属于实际无毒级。图1 不同浓度5#材料的抑菌率2022010年第1期韩绪军等:载ZnO/活性碳复合材料抗菌性能及安全性研究213 口服急性毒性试验20只受试小鼠

19、分为两个组(每组10只),按灌喂剂量,分别喂饲了0104 g 3#和5#复合材料材,另外6只对照组喂饲0104 g活性碳,小鼠受试剂量为2 000 mg/kg体重。经口灌喂小鼠(20只),14 d观察期内无一只中毒或死亡,饲料消耗量及体重不断增加,外观、行为、精神状态、大、小便及其颜色、背毛、肤色、呼吸均正常,鼻、眼、口腔无异常分泌物。经学生t检验和卡方检验,此二处理组与对照组(6只)间的体重等各项指标比较无显著差异(P0105),证明该ZnO/活性碳复合材料口服无毒。214 急性皮肤刺激试验白兔去毛皮肤分别用浓度(凡士林与ZnO/活性碳复合材料比)为11 g和15 g的3#、5#ZnO/活性

20、碳复合材料悬液,处理24 h后,在不同时间观察,未发现处理部位有红斑和水肿反应,与对照部位皮肤比较无异常。ZnO/活性碳复合材料对兔皮肤一次性刺激积分为0,材料对皮肤无刺激性。3 结论抑菌试验表明,高浓度ZnO/活性碳1#-10#复合材料对细菌具有明显的抑制效果(抑制率99%),低浓度的ZnO/活性碳复合材料(011g/mL)对细菌也有较好的抑菌效果(抑制率 90%),对酵母菌的抑制率平均在50%左右。安全性试验表明,ZnO/活性碳复合材料对小鼠经口灌喂半致死剂量LD502 000 mg/kg,对兔皮肤刺激性积分为0,对细胞生长无影响,属于实际生物无毒级。ZnO/活性碳复合材料具有高效抗菌活性

21、,同时使用安全。4 讨论Zn(Ac)2/活性炭是聚乙烯醇生产过程中的必需催化剂,其催化寿命只有5-6个月,因而规模生产时大量废催化剂堆积,对环境造成潜在危害。本研究中的ZnO/活性碳复合材料,为废催化剂经微波加热、高温烧结、蒸馏水洗而制备获得,高温使得其中的残留有机废物被燃烧挥发,高温氧化生成的ZnO被吸附在多孔的活性炭载体材料上,该制备工艺是固体废物再利用和循环经济的有效体现。经烧结活性碳材料保持了其较大比表面积特性,具有良好的吸附作用,除可以负载ZnO外,还可以将微生物吸附在材料表面13,充分发挥ZnO的抗菌活性6-8。此机制是本研究复合材料可能较好抑制受试菌生长的理论基础。1#-10#样

22、品都是ZnO/活性碳复合材料,制备流程相同但条件不同(微波烧结温度、加热时间、蒸馏水漂洗时间等),因而活性碳材料吸附ZnO量及一些其他性质方面可能稍微的不同,同时生产的成本也不一样。一些研究5 已经证实,ZnO/活性碳复合材料的抗菌性能与材料中ZnO的含量及炭化温度有关。因此,本研究将在10种材料中,在保证较高抑菌率的前提下,找到一个制备材料制备成本相对低的工艺用于将来的生产。已有研究报道15在ZnO浓度为10 ppm时其对枯草杆菌的抑制率为90%,而在1 000 ppm时对大肠杆菌的抑菌率为48%。研究中选用了大肠杆菌(G-),金黄色葡萄球菌(G+)、枯草芽孢杆菌(G+)、酵母菌(真菌)为受

23、试菌,因ZnO/活性碳复合材料不溶于水,试验用材料悬液浸泡试验,保障ZnO与菌体可以有效接触,近距离发挥材料的接触抑制作用和可能的氧化杀菌作用,并采用梯度稀释平板培养菌落计数法,检测材料的抑菌率。Tam等16 报道在ZnO的表面能够产生H2O2,能够穿透细菌的细胞壁。这个过程中产生的 O-2和 OH自由基可能杀灭细菌17。检测的结果显示材料对G2和G+细菌均有较高的杀菌活性,提示该材料可能对细菌具有很好的广谱杀灭作用。材料对酵母菌的杀灭作用远远不及细菌,从酵母菌属于真核微生物的角度来考虑,该材料对真核、原核细胞的作用机理或部位可能不一致,推测材料在使用上对真核细胞的安全性。无抗菌材料使用已久,

24、一般认为氧化锌的使用是安全的18,抗菌杀菌作用类似次氯酸,漂白粉等12。现在人们的物质生活水平日渐提高,对健康要求也更高。材料的使用安全性是必须考虑的问题。从材料对细菌的抗菌试验结果来看,1#-10#样品对受试菌的杀灭率相差不多,故在做细胞毒性试验及动物研究时,选择制备工艺相对简单、成本较低的3#和5#材料,评价出该材料系列的生物安全性。研究中从细胞毒性水平,小鼠口服毒性及白兔皮肤刺激试验几个层面证实了材料良好的使用安全302生物技术通报B iotechnologyBulletin2010年第1期性能。氧化锌的最佳抗菌形式尚不确定,制备工艺复杂,资源有限,因而未得到全面研究和广泛应用。ZnO/

25、活性碳复合材料是废催化剂回收利用,成本低,环保节能,材料经高温烧结,不溶于水,稳定性好。因该材料以活性碳为载体,也具有活性碳的基本性质,本研究相关试验也已经证实了该材料同时具有吸附甲醛等有害气体的功能,说明该材料具有多方面的应用价值,为该材料在环保、建筑、包装、家电和日化等方面的应用打下了良好的前期研究基础。参 考 文 献1李梅,王庆瑞,等 1抗菌材料的发展及其应用 1化工新型材料,1998,26(5):821112 W ilczynski,M.Anti2microbial porcelain enamels.Ceram Eng SciProc,2000(21):81283.3 Wang XJ

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27、菌材料研究动态.新材料产业,2007(3):80282.7 Yamamoto O,Sawai J,Sasamoto T1Effect of lattice constant of zincoxide on antibacterial characteristics1Int J Inorg Mater,2000(2):451245418 Sawai J,Kojima H,Igarashi H.Hydrogen peroxide as an antibacterialfactor in zinc oxide powder slurry.J Ferment Bioeng,1998,86(5):521

28、252219 Ysmamoto O,Nakakoshi K.Adsorption and growth inhibition of bac2teria on carbon materials containing zinc oxide.Carbon,2001(39):164321051.10 YamamotoO,SawaiJ,IshimuraN.Preparation and characterizationof novel activated carbons with antibacterial function.Bulletin ofthe Chemical Society of Japa

29、n,1999,107:8532856.11徐瑛,彭善堂,胡善洲.ZnO超细粉的制备及其抗菌性能研究.环境科学与技术(增刊),2003(26):53254.12胡涛,王明丽,吴建军,等 1四针状氧化锌复合抗菌材料滤片抑菌和毒性作用的实验研究 1 疾病控制杂志,2005,9(3):2732274113 Akira K,Makoto S.Tanso,1999(187):1012108.14张微,邹玺,钱晓萍,禹立霞,刘宝瑞.土鳖虫含药血清对肝癌HepG22细胞增殖的抑制作用 1中药新药与临床药理,2007,18(4):2572259.15 AdamsLK,LyonDY,Pedro JJ1Alvare

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