1.1-DNA重组技术的基本工具概述.ppt

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1、烟草烟草据据WTOWTO调查：调查：2004年全世界年全世界因狂犬病致死人数约因狂犬病致死人数约5.5万人万人中国卫生部通报：中国卫生部通报：2004年年月，狂犬病列法定报告传染月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。病死亡数之首。发病死亡率发病死亡率近近100%能产生狂犬病抗体能产生狂犬病抗体蛋白的转基因蛋白的转基因每每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取猪或牛的胰腺中仅可提取45g。1979年，美国将年，美国将人的胰岛素基因人的胰岛素基因重组到重组到大肠杆菌大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药治疗糖尿病特效药治疗糖

2、尿病特效药治疗糖尿病特效药 据据WTO调查：调查：20052005年全世界约有糖尿病患者年全世界约有糖尿病患者年全世界约有糖尿病患者年全世界约有糖尿病患者1.81.8亿亿亿亿人，我国约人，我国约人，我国约人，我国约60006000万。万。胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素思考思考：转基因技术转基因技术转基因技术转基因技术实现了实现了实现了实现了一种生物一种生物一种生物一种生物的某些的某些的某些的某些性状性状性状性状在在在在另一种生物另一种生物另一种生物另一种生物中中中中表达表达表达表达。为什么基因可以在其他种为什么基因可以在其他种为什么基因可以在其他种为什么基因可以在其他种类的生物中表达？类的生物中表达

3、？类的生物中表达？类的生物中表达？密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！DNA(DNA(基因基因基因基因)mRNA mRNA 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质(性状性状性状性状)转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译通用通用基因工程基因工程专题专题1基因工程的基因工程的概念概念别名别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平操作技术操作技术基本过程基本过程结果结果DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平人类需要的新生物类型和产品人类需要的新生物类型和产品剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达体外体外DNA重组和转基因等重组和转基因

4、等专题一专题一 基因工程基因工程“分子手术刀分子手术刀”限制酶限制酶“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体基因进入受体 细胞的载体细胞的载体 1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具HHHA AHC C一、一、“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶12345作用：作用：从特定部位的从特定部位的两个核苷酸之两个核苷酸之间切开间切开（磷酸二酯键磷酸二酯键）12345提示：提示：原核生物在长期的进化过程中产生的保原核生物在长期的进化过程中产生的保护机制，可防止外源护机制，可防止外源DNA的入侵而灭绝。的入侵而灭绝。1.限制酶从哪里

5、寻找？限制酶从哪里寻找？Why？2.为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？不具备这种限制酶的识别切割序列不具备这种限制酶的识别切割序列通过对其中的碱基进行甲基化，使限制酶不能通过对其中的碱基进行甲基化，使限制酶不能将其切开。将其切开。一、一、“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端Sma平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端限制酶所识别的限制酶所识别的序列的特点序列的特点：中心轴线两侧的双链中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是上的碱基是反反向向对称对称重复排列重复排列的。（回文对称序列）的。（

6、回文对称序列）E EcocoR RS Smama识别双链识别双链识别双链识别双链DNA DNA DNA DNA 分子的某种特定的核苷酸分子的某种特定的核苷酸分子的某种特定的核苷酸分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两序列，并且使每一条链中特定部位的两序列，并且使每一条链中特定部位的两序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是主要是主要是主要是原核生物原核生物原核生物原核生物约约40004000种。种。1、来源：、来源：2、种类：、种类：3、作用：、作用：4、结

7、果：、结果：形成两种末端形成两种末端形成两种末端形成两种末端一、一、“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶黏性末端黏性末端平末端平末端2、分类、分类E.Coli DNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶1、作用：、作用：将将双链双链DNADNA片段片段“缝合缝合”起来，恢复被限制起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键。二、二、“分子缝合针分子缝合针”DNA DNA连接酶连接酶 可把可把黏性末端黏性末端之间的缝隙之间的缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNAEcoli DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DN

8、ADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把平末端平末端之间的缝隙之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶区别区别区别区别1 1 1 1区别区别区别区别2 2 2 2相同点相同点相同点相同点寻根问底寻根问底DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键

9、形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)能将能将DNADNA双链上双链上的的两个缺口同时连接两个缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板三三.“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体载体需要的条件：载体需要的条件：有有1 1 多个限制酶切点多个限制酶切点对受体细胞无害对受体细胞无害导入基因导入

10、基因能在受体细胞中复制、表达能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选有某些标记基因，便于筛选常用运载体：常用运载体：质粒质粒 病毒病毒 包括植物病毒、包括植物病毒、动物病毒和物病毒和细菌病毒（噬菌体）菌病毒（噬菌体）假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？录，转基因生物能有预想的效果吗？录，转基因生物能有预想的效果吗？录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车作为分子运输车作为分子运输车作为分子运输车载体，如果没有切割位点将

11、载体，如果没有切割位点将载体，如果没有切割位点将载体，如果没有切割位点将会怎样？会怎样？会怎样？会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？子运输车吗？子运输车吗？子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？（最常用）（最常用）质粒质粒是一种裸露的、结构简单、是一种裸露的、结构简单、独立于独立于细菌拟核细菌拟核DNADNA之外

12、，并且有自之外，并且有自我复制能力的我复制能力的双链环状双链环状DNA分子。分子。能复制并带着能复制并带着能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制因一起复制因一起复制有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在，可用含存在，可用含存在，可用含氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别 实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNADNA分子并不完全具备上述条分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。件，都要进行人工

13、改造后才能用于基因工程操作。已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，的基因，的基因，的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么记基因是什么记基因是什么记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得？请设计实验、预期实验结果，并得？请设计实验、预期实验结果，并得？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。出相应的实验结论。出相应的实验结论。出相应

14、的实验结论。对照组：对照组：对照组：对照组：不添加不添加不添加不添加抗抗抗抗生素生素生素生素实验组实验组实验组实验组1 1 1 1：添加一定浓添加一定浓添加一定浓添加一定浓度的度的度的度的四环素四环素四环素四环素实验组实验组实验组实验组2 2 2 2：添加一定浓度添加一定浓度添加一定浓度添加一定浓度的的的的氨苄青霉素氨苄青霉素氨苄青霉素氨苄青霉素试一试试一试对照对照组组实验实验组组1 1实验实验组组2 2结结 论论预期预期一一预期预期二二预期预期三三预期预期四四对照组：对照组：对照组：对照组：不添加不添加不添加不添加抗生素抗生素抗生素抗生素实验组实验组实验组实验组1 1 1 1：添加一定浓添加

15、一定浓添加一定浓添加一定浓度的度的度的度的四环素四环素四环素四环素实验组实验组实验组实验组2 2 2 2：添加一定浓度添加一定浓度添加一定浓度添加一定浓度的的的的氨苄青霉素氨苄青霉素氨苄青霉素氨苄青霉素既既既既含有抗四环素基因含有抗四环素基因含有抗四环素基因含有抗四环素基因也也也也含有含有含有含有抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因只含有抗四环素基因只含有抗四环素基因只含有抗四环素基因只含有抗四环素基因只含有抗氨苄青霉素基因只含有抗氨苄青霉素基因只含有抗氨苄青霉素基因只含有抗氨苄青霉素基因既既既既不含有不含有不含有不含有抗四环素基因也抗四环素基因也抗四环素基因也抗四环素基因也不不不不含有含有含有含有抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因模拟制作模拟制作用剪刀在特定部位用剪刀在特定部位对棉花棉花DNA进行模行模拟切割，并将模切割，并将模拟毒蛋白基因取出，再用毒蛋白基因取出，再用胶胶纸模模拟基因种基因种间连接。接。棉花的棉花的棉花的棉花的一段一段一段一段DNADNADNADNA 含毒蛋白基含毒蛋白基含毒蛋白基含毒蛋白基因的细菌因的细菌因的细菌因的细菌DNADNA片段片段片段片段