苦瓜色素与色素蛋白的提取及生物学特性的研究.pdf

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1、目录I I I l l l l lI l i l li l ll l l mn lY 2 3 3 2 9 5 5摘要1A b s t r a c t 3前言51 1 天然食用色素51 1 1 食用色素概述51 1 2 天然色素的开发利用现状51 1 3 天然色素的提取方法6I 2 苦瓜概述101 2 1 苦瓜的营养成分1 01 2 2 苦瓜的化学成分【4 6】111 3 苦瓜药用成分的生理功能及作刚机理1 2l。3 1 抑菌作用1 21 3 2 降血糖作用1 31 3 3 抗氧化作用1 51 1 3 4 抗肿瘤作用1 51 3 5 免疫调节作用1 61 3 6 抗病毒作用1 71 3 7 抗艾

2、滋病作用1 81 3 8 抗生育作用181 4 研究的目的和内容1 91-4 _ I 研究目的和意义1 91 4 2 研究内容2 0第+章苦瓜子衣色素的研究2l引言2 1l 材料与方法2 11 1 试验材料2l1 2 试验方法2 21 3 苦瓜子衣色素成分薄层层析定性分析一2 52 结果与分析2 62 1 筛选确定最佳提取【：艺条件及溶剂2 62 2 苦瓜色素稳定性的影响冈素3 02 _ 3 苦瓜子衣色素成分薄层层析定性分析3 43 讨论3 4第二章苦瓜子衣总蛋白的提取分离3 6引言3 61 材料与方法3 61 1 试验材料一3 61 2 试验方法3 72 结果与分析3 83 讨论3 9第三章

3、苦瓜色素蛋白的分离4 2引言4 21 材料与方法4 21 1 材料4 21 2 试验方法4 32 结果与分析4 62 1 硫黢铵沉淀法分级制备苦瓜蛋白的电泳掏谱一4 62 2 双水相法提取苦瓜子衣蛋白两相最佳浓度韵确定4 93 讨论5 3第四章苦瓜色素蛋白的纯化及生化特性研究5 4引言5 4l 材料与方法5 51 1 试验材料5 51 2 试验方法5 62 结果与分析6 02 1 苦瓜色素蛋白的纯化6 03 讨论一6 5结论一6 7参考文献6 8致谢7 4C e n t e n t sA b s t r a c t 1E n g l i s ha b s t r a c t 3P r e f

4、a c e 1 1N a t u r a lf o o dc o l o r i n g 51 1 1F o o dc o l o r i n go v e r v i e w 51 1 2T h ed e v e l o p m e n ts t a t u so f f o o dc o l o r i n g 51 1 3E x t r a c t i o no f n a t u r a lp i g m e n t 1 1 3 1S u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n 61 1 3 2M e m b r a n es

5、 e p a r a t i o nt e c h n o l o g y 61 1 3 4U l t r a s o n i ca s s i s t e de x t r a c t i o n 71 1 3 5L i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 71 1 3 6A q u e o u st w o-p h a s ee x t r a c t i o n 8l 137M o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n 81 2M o m o r d i c aC h a r a n t i ao v e r v i

6、e w 1 01 2 I T h en u t r i t i o n a lc o n t e n to f M o m o r d i c aC h a r a n t i 1 01 2 2C h e m i c a lc o m p o s i t i o no f M o m o r d i c aC h a r a n t i。1 11 3M o m o r d i c aC h a r a n t i am e d i c i n a li n g r e d i e n t sa n dm e c h a n i s mo ft h ep h y s i o l o g i c

7、a lf u n c t i o n 1 21 3 1I n h i b i t i o ne f f e c t 1 21 3 2H y p o g l y c e m i ce f f e c t 1 31 3 3A n t i o x i d a n t1 3 4A n t i t u m o r。1 51 3 5I m m u n er e g u l a t i o n 1 61 3 6 A n t i v i r a l。1 71 3 7T h er o l eo fa n t i-A I D S 1 81 3 8A n t i-f e r t i l i t ye f f e c

8、 t 1 91 4S i g n i f i c a n c ea n dc o n t e n t so ft h i st h e s i s 1 91 4 1T h ep u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c e 1 91 4 2C o n t e n t。2 0C h a p t e rI：T h es t u d yo nM o m o r d i c aC h a r a n t i as u b s k i np i g m e n t 21I n t r o d u c t i o n 一21lM a t e r i a l sa n dm

9、 e t h o d s 1 1E x p c r e m e n tm a t e r i a l s 2 11 1 1M a i nr e a g e n t s。2 11 1 2M a i ni n s t r u m e n t s 2 11 2E x p e r e m e n tm e t h o d s，2 21 2 1M a t e r i a l sh a n d l i n g2 21 2 2O p t i m u mc o n d i t i o n sa n do p t i m i z i n gt h es o l v e n t 2 21 2 3F a c t O

10、 体a f f e c t i n gt h es t a b i l i t yo fM o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n t 2 31 3M o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n tc o m p o s i t i o nT L Cq u a l i t a t i v ea n a l y s i s 1 3 1P r e p a r a t i o no f s i l i c ag e lGt h i nl a y e rp l a t e 1 3 2M o m o r d i

11、c aC h a r a n t i ap i g m e n tc h r o m a t o g r a m s 2 52 S2R e s u l t sa n da n a l y s i s 2 1S c r e e n i n gt od e t e r m i n et h eo p t i m a le x t r a c t i o nc o n d i t i o n sa n ds o l v e n t s2 52 62 1 1M o m o r d i c aC h a r a n t i ad e t e r m i n a t i o no f t h em a x

12、 i m u ma b s o r p t i o nw a v e l e n g t hp i g m e n t。2 62 1 2E x t r a c t i o nt i m eo ne x t r a c t i o no f M o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n t 2 72 1 3L i q u i dr a t i oo nt h ee x t r a c t i o no fb i t t e rm e l o np i g m e n t 2 I l2 1 4P i g m e n te x t r a c t i o

13、 nt e m p e r a t u r eo ne x t r a c t i o no f M o m o r d i c aC h a r a n t i a 2 1 5O r g a n i cs o l v e n te x t r a c t i o np i g m e n to r t h o g o n a i 3 02 2M o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n ts t a b i l i t yf a c t o r 3 02 2 1T e m p e r a t u r eo np i g m e n ts t a

14、b i l i t yo f M o m o r d i c aC h a r a n t i a 3 02 2 2P Ho nt h es t a b i l i t yo f M o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n t 3 12 2 3O x i d a n t so nt h es t a b i l i t yo f M o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n t 3 22 2 4R e d u c i n ga g e n t so nt h es t a b i l i t yo f

15、 M o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n t 3 22 2 5L i g h tO i lt h es t a b i l i t yo f M o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n t 3 32 2 6M e t a li o n so nt h es t a b i l i t yo fM o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n t 3 42 3M o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n tc

16、o m p o s i t i o nT L Cq u a l i t a t i v ea n a l y s i s 3 43D i s c u s s i o n 3 5C h a p t e r：E x t r a c t i o no f t o t a lp r o t e i no f M o m o r d i c aC h a r a n t i as u b s k i n。3 6I n t r o d u c t i o n 3 6lM a t e r i a l sa n dm e t h o d s 3 61 1E x p e r e m e n tm a t e r

17、 i a l s 3 61 1 1P l a n tm a t e r i a l s 3 61 1 2M a i nr e a g e n t s 3 61 1 3M a i ni n s t r u m e n t s j 1 71 2E x p e r e m e n tm e t h o d s 3 71 2 1D i f f e r e n ts t a g e so fm a t u r i t ys u b-s k i nP r e p a r a t i o no ft o t a lp r o t e i n 3 71 2 2D i f f e r e n ts t a g

18、e so fm a t u r i t ys u b-s k i nP r e p a r a t i o no ft o t a lp r o t e i nS D S-P A G E 3 72R e s u l t sa n da n a l y s i s 3 83D i s c u s s i o n 4 0C h a p t e r：S e p a r a t i o no f M o m o r d i c aC h a r a n t i ap i g m e n tp r o t e i n 4 0I n t r o d u c t i o n 1M a t e r i a l

19、 sa n dm e t h o d s4 01 1M a t e r i a l s 4 01 1 1P l a n tm a t e r i a l s 4 01 1 2M a i nr e a g e n t s 4 11 1 3M a i ni n s t r u m e n t s 4 l1 2E x p e r e m e n tm e t h o d s 4 11 2 1P r e t r e a t m e n to ft h em a t e r i a l 4 11 2 2A m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o

20、 nm e t h o dM o m o r d i c aC h a r a n t i a 4 11 2 3T h eS D S P A G Ei d e n t i f i c a t i o nf r a e t i o n a t eM o m o r d i c aC h a r a n t i ap r o t e i n s 4 21 2 4D e t e r m i n a t i o no fb e s tt w o-p h a s eo fA q u e o u st w o-p h a s ee x t r a c t i o no f M o m o r d i c

21、aC h a r a n t i ap r o te i nc o n c e t r a t i O n 4 21 2 5A q u e o u st w o-p h a s ee x t r a c t i o no f M o m o r d i c aC h a r a n t i ap r o t e i n 4 32R e s u l t sa n da n a l y s i s 4 52 1P i g m e n tp r o t e i ng e le l e c t r o p h o r e s i so fp r e p a r a t i o na m m o n i

22、 u ms u l f a t ef r a c t i o n a t i o n4 52 2D e t e r m i n a t i o no fb e s tt w o-p h a s eo fa q u e o u st w o-p h a s ee x t r a c t i o no fM o m o r d 缸aC h a r a n t i ap r o te i nc o n c e n t r a t i o n 4 82 2 1T h ee f f e c to fa m m o n i u mc o n c e n t r a t i o ns u l f a t e

23、p r o t e i n 4 l I2 2 2T h ee f f e c to f P E G c o n c e n t r a t i o ne x t r a c tp r o t e i n 4 92 2 3S D S-P A G Eo fa q u e o u st w o p h a s ee x t r a c t i o no f M o m o r d i c aC h a r a n t i ap r o t e i n 5 0：ID i s c u s s i o n 5 2C h a p t e rI V-s t u d yo np i g m e n tp r o

24、 t e i np u r i f i c a t i o na n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s 5 3I n t r o d u c 4 i o n 1M a t e r i a i sa n dm e t h o d s5 31 1E x p e r e m e n tm a t e r i a l s 5 41 1 1M a i n 嘲g e n 担。5 41 1 2S o l u t i o nc o n f i g u r a t i o n 1 1 0M a i ni n s t r u m e n 括1

25、2E x p e r e m e n tm e t h o d s5 41 2 1P u r i f i c a t i o no f s u b-s k i np i g m e n tp r o t e i n 5 51 2 2M o l e c u l a rw e i g h td e t e r m i n a t i o no fp u r i f i c a t i o np i g m e n tp r o t e i n1 2：IP Id e t e r m i n a t i o no fp u r i f i c a t i o np i g m e n tp r o t

26、 e i n 5 71 2 4S u b u n i ts t r u c t u r ea n a l y s i so fp u r i f i c a t i o np i g m e n tp r o t e i n 5 81 2 5S c a v e n g i n go fh y d r o x y lr a d i c a l(o n)t e s tp u r i f i c a t i o np i g m e n tp r o t e i n j!R e s u l t sa n da n a l y s i s 5 92 1P u r i f i c a t i o no

27、f s u b-s k i np i g m e n tp r o t e i n 5 92 1 1T h er e s u l t so f D E A E-5 2a n i o nc h r o m a t o g r a p h y 5 92 1 2T h er e s u l t so f S e p h a d e xG-1 0 0 9 e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y 5 92 1 3S D S-P A G Et e s tt h ep u r i t yo fp i g m e n tp r o t e i n 2 1 4M o

28、I e c u I a rw e i g h td e t e r m i n a t i o no f p u r i f i c a t i o np i g m e n tp r o t e i n 6 12 1 5P Id e t e r m i n a t i o no fp u r i f i c a t i o np i g m e n tp r o t e i n 2 1 6D i s u l f i d ea n a l y s i so f p i g m e n tp r o t e i n 6 32 1 7D e t e r m i n a t i o no f s c

29、 a v e n g i n gp i g m e n tp r o t e i n 3D i s c u s s i o n 6 4C o n c l u s i o n s 6 6R e f e r e n c e 6 8A c k n o w l e d g e m e n t 7 4缩写词及其英汉对照青岛农业人学硕 j 学位论义摘要苦瓜色素与色素蛋白的提取及生物学特性的研究摘要苦瓜(M o m o r d i c ac h a r a n t i aL)系葫芦科草本植物，富含多种营养成分，作为一种传统的蔬菜和中药，具有药膳同源之功效。其子衣色素可以作为一种天然食用色素，广泛应用于食品、

30、日化、医药等行业。不仅可作为添加剂为食品着色，有的品种由于保留了植物体内的多种天然活性物质，如维生素、氨基酸、核苷酸、小分子活性肽、芳香物质及某些必需元素等，还兼有营养保健功能。本试验以不同成熟度苦瓜子衣为材料，应用硫酸铵沉淀法和双水相提取法均得到苦瓜色素蛋白；经过D E A E 5 2 阴离子层析、S e p h a d e xG 1 0 0 凝胶柱层析进一步分离纯化苦瓜色素蛋白；同时运用生化一分子生物学技术研究纯化苦瓜色素蛋白的生物学特性及抗氧化性。主要试验结果有：1 通过紫外可见吸收光谱图可以得出苦瓜色素的最大吸收波长为4 7 4 n m，由正交试验可以确定苦瓜子衣色素提取的最佳条件为：

31、温度5 0。C，料液比为1 4 0g m l，时间为3 0 m i n 时苦瓜色素的提取率最高为4 5 5 4。2 纯化苦瓜子衣色素具有较好的稳定性。但是高温、强光照、在偏酸或偏碱的环境、氧化剂还原剂的存在，以及高浓度的金属离子都会对苦瓜子衣色素的稳定性构成威胁，因此提取时要尽量避免。3 通过薄层层析可以得出苦瓜子衣色素中有至少有两种比较多的色素：1 3-胡萝卜素和番茄红素。4 4 0、4 0 一8 0 石L 酸铵分级制备蛋白S D S P A G E 凝胶电泳结果显示：4 0 硫酸铵沉淀蛋白主要含有一种，分子量约为2 0 k D；即没有差异条带。而4 0 一8 0 硫酸铵出多种蛋白质并且包含

32、差异条带。用双水相法提取的各阶段的蛋白质S D S P A G E 凝胶电泳，二者均用凝胶处理软件B a n d S c a n 5 0 对图像进行处理，结果均发现目的条带。5 4 0 一8 0 硫酸铵沉淀的蛋白上D E A E 纤维素柱，得到两个吸收峰，再过S e p h a d e xG 一1 0 0 柱进一步纯化得到目的蛋白，S D S P A G E 电泳图片显示：纯化苦瓜色素蛋白的分子量为7 4 I k D，等电点为7 2，存在链间二硫键。6 纯化苦瓜色素蛋白和4 0 一8 0 硫酸铵沉淀蛋白清除羟自由基的能力相差不大。都是随着质量浓度的增加抗氧化性增强，但是，前者在同等的质量浓度下

33、均稍弱于后者。二者均不及抗坏血酸的抗氧化性。本研究确立了苦瓜色素的最佳提取条件，对子衣色素进行了的定性分析以及对色素稳定性进行了探究，分离纯化出与色素形成相关联的色素蛋白，并得出了其生物学特性，青岛农业人学硕I：学位论文摘要和抗氧化性的效果，因此色素形成与色素蛋白存在密切相关，色素蛋白在色素形成中的作用机理有待探讨，以期为其在食品科学和生命科学领域的应用提供新的线索和依据。关键词：苦瓜色素蛋白；分离纯化；柱层析；抗氧化作用重堕堕型生鳖兰塑兰兰望塑竺鉴一茎塞塑塞一7 】l XS t u d yo nB i o l o g yA c t i v i t ya n dE x t r a c t i

34、n go fm o r d i c aC h a r a n t i aP i g m e n ta n dP i g m e n tP r o t e i nA b s t r a c tM o m o r d i c ac h a r a n t i aL i sa nh e r b a c e o u sp l a n to fc u c u r b i t a c e a ew h i c hh a sv a r i o u sn u t r i t i o n a lc o m p o n e n t s A sak i n do ft y p i c a lt r a d i t

35、i o n a lm e d i c i n eh e r b，M o m o r d i c ac h a r a n t i ac a nb eu S e da Sf o o da n dm e d i c i n e A n di t ss u b s k i np i g m e n tc a na l s oa r ew i d e yu s e da san a t u r a lf o o dc o l o r i n 舀i nf o o d，c o s m e t i ca n dp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e s N

36、o to n l yc a l lb eu s e da sa d d i t i v e sf o rt h ef o o dc o l o r i n g，s o m es p e c i e sa I s Oh a v en u t r i t i o u sh e a l t hf u n c t i o n b e c a r s eo fr e t a i n i n gt h en a t u r a la c t i v es u b s t a n c e ss u c ha sv i t a m i n s a m i n oa c i d s，n u c l e o t

37、i d e s，s m a l lm o l e c u l ep e p t i d e，a r o m a t i cs u b s t a n c e sa n dc e r t a i ne s s e n t i a le l e m e n t s e t c,t h e r e f o r e，I nt h i se x p e r i m e n t,n i n ed i f f e r e n ts t a g e ss u b s k i na Sm a t e r i a l，b o t ha m m o n i u ms u i f a t ep r e c i p l

38、 t a t l o na n da q u e o u st w o p h a s ee x t r a c t i o no b t a i np i g m e n tp r o t e i n；t h r o u g hD E A E 5 2a n i o n。h m m a t o g r a p h ya n dS e p h a d e xG 一10 0g e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yf u r t h e rp u r i f i e d 胸砌口c 厅蝴砌p l g m e n tp r o t e i n；a st h

39、es a m et i m eu s e dc h e m i c a la n db i o l o g i c a l M o l e c u l a rB i o l o g yr e s e a r c hD u r i f i c a t i o np i g m e n tp r o t e i na n db i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n do x i d a t i o n M a i nr e s u I t sa r e 1 B yU V-v i s i b l ea b s o r p t i o ns

40、 p e c t r ao fp i g m e n tc a nb ed r a w nt h a tm a x i m u ma b s o r p t i o nw a v e l e n g t ho fp i g m e n ti s4 7 4 n m，t h eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o n so f M o r d i c ac h a r a n t i as u b s k i np i g m e n tc a nb ed e t e m l i n eb Yt h eo r t h o g o n a lt e s

41、t：t e m p e r a t u r e5 0，p r o p o r t i o no fs o l i dt ol i q u i di s1 4 0g m 1，t i m e3 0 m i n，M o r d i c ac h a r a n t i ap i g m e n te x t r a c t i o nr a t eu pt o4 5 5 4 2 P 嘶f i c a l i o no fM o r d i c 口c h a r a n t i as u b s k i np i g m e n th a sag o o ds t a b i l i t y H o

42、w e v e r，b i g ht e m p e r a t u r e s 仃o n gl i g h t，a n da o i d i cp Ho rs l i g h t l ya l k a l i n ee n V i r o n m e n t，t h ep r e s e n c eo fo x i d a n ta n dr e d u c i n ga g e n t，a n dh i g hc o n c e n t r a t i o n so fm e t a li o n st h r e a tt h es t a b i l i t yo fs u b s k

43、 i np i g m e n t，s ow es h o u l dt r Vt oa v o i dt h e mw h e nb ee x t r a c t e d 3 1w om o r ep i g m e n t sb ec o n t e n t e di nM o r d i c ac h a r a n t i as u b s k i np i g m e n ta tl e a s tb yT L C：1 3-c a m t e n ea n dl y c o p e n e 3青岛农业人学硕l：学位论文英文摘要4 T h er e s u l to f 4 0，4 0

44、 一8 0 a m m o n i u mp r e p a r a t i o np r o t e i no f S D S P A G Eg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w e dt h a t：4 0 a m m o n i u ms u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n,c o n t a i n sap r o t e i no f m o l e c u l a rw e i g h ta b o u t2 0 k D；t h a ti sn o tao b v i o u sd i f f

45、e r e n tb a n d A n d4 0-8 0 a m m o n i u ms u l f a t ep r o t e i nc o n t a i n sav a d e t yo fd i f f e r e n tb a n d s E x t r a c t i o np r o t e i n so fu s i n ga q u e o u st w o-p h a s ei nd i f f e r e n ts t a g e so f S D S P A G Eg e le l e c t r o p h o r e s i s，b o t ho fB a n

46、 d S c a n 5 0g e li m a g ep r o c e s s i n gs o f w a l et op r o c e s s，t h er e s u l ti sf o u n dt h es a m eb 鲫d 一一t a E g e tb a n d 5 4 0 8 0 a m m o n i u ms u l p l l a t ep r e c i p i t a t i o np r o t e i np a s st h r o u g hD E A E 5 2c e l l u l o s ec o l u m n，t w op e a k sa p

47、 p e a r，t h e np a s st h r o u g h 却h a d e xG 一1 0 0c o l u m nf o rf u r t h e rp u r i f i c a t i o no fp i g m e n t-p r o t e i nM o r d i c ac h a r a n t i ao b t a i nt a r g e tp r o t e i n S D S-P A G Ee l e c t r o p h o r e s i si m a g es h o w e dt h a t：t h em o l e c u l a rw e i

48、 g h to fP u r i f i e dp i g m e n tp r o t e i ni s7 4 1 k D，i s o e l e c t r i cp o i n tp i g m e n tp r o t e i ni s 7 2a n dt h e r ei sai n t e r-c h a i nd i s u l f i d eb o n d 6 B o t hp u r i f i e dM o r d i c ac h a r a n t i ap i g m e n t-p r o t e i na n d4 0 一8 0 a m m o n i u ms

49、u l f a t ep r o t e i np r e c i p i t a t i o nh a v et h es a m ee l i m i n a t ec a p a c i t y T h e i re l i m i n a t ec a p a c i t yi n c r e a s e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fs M u t i o ni n c r e a s e d，b u tt h ec a p a c i t yo f t h ef o r m e ri nt h es a m ec 0 4 a c

50、e n t r a t i o nw e r ew e a k e rt h a nt h el a t t e r T h et w oa t ew e a k e rt h a na s c o r b i ca c i do x i d a t k m T h es t u d ye s t a b l i s h e dt h eo p t i m a le x t r a c t i o nc o n d i t i o n so fM o r d i c ac h a r a n t i ap i g m e n t，h a v eaq u a l i t a t i v ea n