同步荧光光谱法.ppt

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1、 4-34-3 同步荧光光谱法同步荧光光谱法 (Synchronous Fluorescence)一、同步荧光分析原理 同步荧光技术是同时扫描激发单色器和发射单色器波长的情况下来测绘荧光光谱图。由测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图，称为同步荧光光谱。SYNCHR.EX.SCANNOR.EM.SCANNOR.EX.SANNO FLUORESCATTER LINE/nmnm1、固定波长的同步荧光光谱(Constant wavelength synchronous luminescence ,CWSL)(1)在同步扫描中，使激发波长与发射波长保持固定的波长间距，即 常数。将同步荧光信号对发射或激

2、发波长测绘荧光光谱图，则为固定波长的同步荧光光谱。（2）定量依据激发光谱强度分布发射光谱强度分布（2）同步扫描激发波长时的发射光谱（3）同步扫描发射波长时的激发光谱（2）（3）（1）（3）同步荧光光谱的特点 a.同步光谱与激发光谱及发射光谱都有关系。它同时利用了化合物的吸收特性和发射特性，因而使光谱分析的选择性得到改善。b.有利于多组分混合物的分析。同步荧光光谱可以把强带增强而减小弱带的干扰。c.可消除 Raylei 干扰，使 Roman 强度降低且拉宽。（4）的选择只有当 恰好相当于某吸收带和其发射带之间波长间距时，才能观察到同步信号。=斯托克斯位移（发射波长与激发波长之差)与狭缝宽度 d

3、的大致原则：只受瑞利：当同时受瑞利和拉曼散射干扰 测定波 拉曼散射光的波长 2、固定能量的同步荧光光谱 constant energy synchronous luminescence (CESL)固定能量的同步荧光光谱，是指在同步扫描过程中，使激发波长与发射波长之间保持着固定的能量差。RayRoman常数表示波数差与 成正比拉曼光与入射光之间的频率差称为拉曼位移当或时 固定能量的同步荧光光谱可消除瑞利散射和拉曼散射，而固定波长的同步荧光光谱只能消除瑞利散射，使拉曼散射拉宽。二者皆能降低光谱的复杂性，提高选择性。abcF二、同步扫描仪器设备1、固定波长的荧光光谱的获得 对于以光栅为单色器的荧光

4、分光光度计，只要分别设置激发和发射两个单色器所需的起始波长，并使它们以同样的速率进行扫描，便可进行固定波长同步扫描荧光测定。2、固定能量同步扫描 是非线性的可变角同步扫描，需通过微处理机控制而加以实现。三、应用1、在多环芳烃分析中的应用 减小光谱的重叠（1）固定波长同步荧光法用于煤中多环芳烃的测定 苊(Ace)，2,3-苯并芴(BF)，蒽(Ant)，苯并芘(Bap)，苝(Per)用标准加入法计算2,3-苯并芴（2）低温固定能量同步荧光法煤液化样品中各种有机物的同步荧光光谱煤液化样品的固定波长同步荧光光谱2、同步荧光法在医药检验方面的应用（1）违禁药品中苯丙胺和吗啡加奎宁麦角酸二乙酰胺的测定（2

5、）二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽（3）酪氨酸和色氨酸严重重叠CWSL的同步荧光 色氨酸的光谱特征的同步荧光 酪氨酸的光谱特征 or 70nm 的二阶导数同步荧光可对 Trp 和 Tyr 分辨同步荧光可对Trp、Tyr、Phe分辨（4）维生素B1、B2混合物中维生素B1的测定 用铁氰化钾将B1氧化硫胺荧（5）尿液中肾上腺素和去甲肾上腺素的同时测定总结：荧光测量稳态测量时间依赖的测量 4-4 4-4 时间分辨荧光法时间分辨荧光法（Time Domain Fluorometry）(Time Resolved Fluorometry）一、时间分辨法原理 用短脉冲光源激发的荧光体群体，随时间而衰变，其衰变率为

6、受激分子的寿命用 F(t)或 N(t)对 t 作图1/eF(t)or N(t)tort荧光寿命为荧光强度衰变到初始值的 1/e 所需要的时间。特点：采用适当的激发光源和检测体系，可以得到在固定波长的荧光强度时间曲线和在固定时间的荧光发射光谱。（1）可以对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分进行分辨；（2）可消除杂质与背景荧光；（3）可测量溶剂松弛的时间。二、时间分辨仪器设备激发光源、时间延迟设备、激发单色器、样品池、荧光单色器及设有门控的检测器1、激发光源 短脉冲的激发光源闪光灯氮闪光灯 几条高强度射线氢闪光灯氘闪光灯连续线 强度低激光器氮分子激光器 337.1 nm氩离子激光器 351 nm染料

7、激光器 所需波长光子通量大、峰值功率高、单色性好、发生的光脉冲持续时间短，激光荧光法具有较高的灵敏度和选择性。2、检测器 如光电倍增管 带有门控的三、时间分辨荧光的分析应用荧光体的荧光寿命的测定时间分辨荧光光谱荧光发射的衰变曲线1、荧光体混合物中两组分的同时测定例 用8-羟基喹啉-5-磺酸(R)同时测定Al 和Ga 15.20 ml 样品 +1 ml 0.045%R +2 ml 20%NH4Ac(or 20%NH4Cl)调 pH 至4.5，稀释至25 ml 氘灯激发 测定荧光强度时间曲线 （1）测定荧光衰变曲线 Al RGa R可利用上述两个荧光化合物的差异对它们进行同时测定。（2）计算含量铝

8、配合物和镓配合物的衰变曲线铝配合物和镓配合物的对数衰变曲线比较（1）和（4）的荧光强度得Al的含量比较（2）和（5）的荧光强度得Ga的含量2、芳基的测定 例 用ps双色荧光法对卤素芳族化合物光离解作用所产生的芳基进行检测（1）用25ps，266nm 激光脉冲使1-(氯甲基)萘，1-(溴甲基)萘，2-(氯甲基)萘，2-(溴甲 基)萘等化合物离解产生芳基。（2）在延迟60ps后，用25ps，355nm激光脉冲激 发芳基的荧光，产生橙色荧光，600nm，10ns，如图所示。（a）和（c）一致，是1-萘甲基所致（b）和（d）一致，是2-萘甲基所致3、溶剂松弛时间的分辨测量 许多分子在基态时具有从中等到

9、大的偶极矩，在激发态时偶极矩发生变化，从而引起周围溶剂分子中电子的重排和溶剂分子围绕激发态溶质分子偶极的重新定向，这个过程称为溶剂松弛，这个过程所需的时间叫溶剂松弛时间。在松弛过程中，能量有所降低，因而发射向长波位移。时间分辨荧光法可记录不同时间的发射光谱，因而可测量松弛时间。例1 4-氨基苯邻二酰亚胺（4-AP）的丙醇溶液 在不同的温度下的时间分辨的荧光光谱图室温下，-132 荧光光谱与时间t无关在-77K，荧光光谱与t 有关在 4ns，溶剂还未重新取向在23ns，溶剂取向已完成例2 2-对-苯甲基萘-6-磺酸盐染料溶剂 甘油温度 A图 4 1.8 ns,8.0 ns,12.2 ns B图

10、57 1.8 ns,8.0 ns,12.2 ns 4-5 相分辨荧光法（Frequency-Domain Fluorometry /Phase-Modulation Fluorometry)The objective of both time-domain and frequency-domain fluorometry is to recover the parameter describing the time-resolved decay.一、相分辨法原理 1、单指数衰变的荧光 当样品被激发光激发而发射荧光时，如激发光的光强度被正弦调制，其角调制频率为，则发射光也同样被调制。由于吸收和发

11、射之间的时间延迟，调制的发射光比起激发光在相上延迟了角。但发射光的调制比起激发光的调制小一些，也即是发射光的改变部分的相对幅度比起激发光要小些。去调制因素激发光和发射光的光强正弦调制在测量相角（）或去调制因素（m）之后，可以计算该荧光体的荧光寿命。相分辨法是荧光寿命的测量方法之一。m10 MHz30 MHz10 MHz30 MHz、m与 的关系如下：m 随 的增大而下降m=1 发射光与激发光的调制幅度相同m 越小 发射光被调制的幅度越小 随 的增大而增大，寿命越长，延迟的 越大。当荧光分子的寿命越长，发射相对于激发延迟的时间就越长。2、多指数衰变的荧光 如果样品中含有两种荧光体，或者单一荧光体

12、而进行进一步激发态反应，则荧光是双指数衰变。如果进行多步反应，则荧光是多指数衰变。由 和 m 所计算的 是表观荧光寿命。如采用相灵敏检测器的相荧光计，激发光的调制度（或振幅）去调制因素单一荧光体对于相灵敏检测器 稳态荧光光谱 检测角度在不同相角 测定荧光光谱，称为相灵敏荧光光谱，即为在固定时间的荧光光谱。若样品溶液中含有 A、B 两种荧光体，它们的荧光寿命分别为A和B。如，则该组分的发射被抑制 要得到混合物中组分A的稳态光谱，须把检测器相角调节至和组分B正交。这是很费时的，最好得到另外的信息:(1)先得到任何一组分的稳态荧光光谱，然后调节检测器相角至该荧光光谱和混合物的荧光光谱重叠，则可得到与

13、另一组分正交的相角。(2)使用任何一组分的纯溶液以确定检测器的相角。当用相灵敏检测器在各种不同检测器相角测绘样品的相灵敏荧光光谱。对于单一化合物，其荧光峰波长基本上保持不变而与检测器相角无关。如果不是均匀的发射，则荧光峰随着检测器相角而改变，在不同检测器相角得到的相灵敏光谱是鉴别不均匀发射的有力工具。3、相分辨荧光法与时间分辨荧光法比较 用于荧光参数测量的仪器可分为两大类稳态测量 steady-state时间依赖的测量 time dependent相分辨荧光法与时间分辨荧光法本质上都是时间依赖或时间分辨的测量。（1）仪器 时间分辨荧光法的局限性 a.仪器常常非常复杂，常局限于有关专家使用；b.

14、灵敏度常低于稳态测量。相分辨法的优点 a.仪器类似于稳态测量的仪器，使用简单；b.灵敏度高；c.数据处理快。（2）测量参数 a.F(t)-t 曲线 时间分辨 b.m.相分辨（3）从实验的观点，相分辨有下列优点：在时间分辨的方法中，测量的延迟信号的去卷积对于计算测量系统的限定时间的响应是必要的，而相分辨法不受此限制；相分辨法允许不同方向的直接测量。如在各向异性的延迟测量中，平行和垂直偏振成份的 和 m 的测定；相分辨法为基于荧光寿命差异的光谱成份之直接分辨提供了一种简单、有效的方法。二、相分辨仪器设备 与一般荧光分光光度计大致相似，但增加了光调制器及测量相角和去调制因素的设备。1、光调制器（1）

15、Kerr 调制器 不能透射UV（2）Pockels调制器 需要较低电压，能透过紫外光，可在连续 可变的频率下操作，但要求高度准直的光，适用于以激光器为光源的相分辨荧光计。（3）Dedye-Sears 超声波调制器 能透过紫外光，对光准直的要求不太高，可用于各种光源。2、检测系统 由单色器，光电倍增管，锁定放大器组成。锁定放大器只检测与参比信号相同频率且具有一定位相关系的信号成份，从而大大提高了信噪比。三、相分辨荧光的分析应用1、荧光体两组分混和物中个别组分的荧光光谱的直接记录和荧光寿命的测定2对甲苯氨基6萘磺酸（TNS）和6丙酰2（二甲基氨基）萘（PRODAN）混合物在乙醇溶液中a.稳态荧光光

16、谱b.相灵敏荧光光谱c.调整 DPRODAN被抑制TNS的荧光光谱，=3.6 nsTNS被抑制PRODAN的荧光光谱，=11.6 ns当当TNS 和 PRODAN 的稳态荧光光谱TNS-PRODAN混合物的相灵敏荧光光谱从混合物直接记录下的TNS和PRODAN的荧光光谱2、溶剂松弛的相分辨 在溶剂松弛过程中，一般情况能量有些降低，松弛态发射光谱红移。但降低温度会使光谱蓝移。N-乙酰基-L-色氨酸胺（NATA）solvent:丙稀甘油 （1）不同T下的荧光光谱 （2）相灵敏荧光光谱 在固定D即t下所得到的荧光光谱NATA 在丙烯甘油中的荧光光谱NATA 在丙烯甘油中的相灵敏荧光光谱 4-6 荧光

17、动力学分析法（Fluorescent Kinetic Analysis)一、动力学法原理 由于化学反应的速率与反应物的浓度有关，在某些情况下与催化剂的浓度有关，因此可以通过测量反应的速率以确定待侧物的含量。光度法电位法荧光法测速率以荧光法监测反应速率，这种方法则称为荧光动力学分析法。a A+b B a A+b B n C+m D n C+m D =kA=kAa a BBb ba=1 b=1a=1 b=1 =kAB=kAB1、荧光动力学分析的特点（1）优点 a.只观测反应初期的速率，可用于某些反应速率慢、平衡常数小或可能发生副反应的化学反应；b.动力学分析是一种相对测量,动力学分析法有可能比平衡

18、法具有更好的选择性;c.灵敏度高、操作较快、易于实现自动化。（2）局限性 a.所使用反应的半衰期应在5ms到1h之间;b.必须严格地控制温度、pH、试剂浓度、离子强度等反应条件和其它可能影响反应速率的因素；c.动力学测量的信噪比在本质上要比平衡法小,只有反应的一小部分用于测定；d.试样基质的干扰问题仍可能发生,如降低有效浓度,与分析物结合。2、荧光动力学分析法非催化法催化法酶催化法（1）非催化法 通过测量非催化反应的速率而测定某种反应物的浓度。（2）催化法 以催化反应为基础来测定物质含量的方法。催化反应速率与催化剂的浓度成正比，因此可测定催化剂的浓度，也可用于测定某些对催化反应起助催作用或抑制

19、作用的物质。例:8-羟基喹啉-5-磺酸+过硫酸铵Ag+(3)酶催化法 基于酶催化的反应，这类反应的突出优点是它的特效性和高灵敏度,不仅可用来测定酶的活性,也可用来测定底物、活化剂和抑制剂.3、反应速率的荧光法监测 假如化学反应的某种反应物或产物是荧光物质,便可利用荧光法来监测反应的速率。记 F-t 曲线 可通过正切法(斜率法)或固定时间法或固定荧光强度法获得校正曲线。（1）正切法 从F-t曲线求反应速率然后用 作图c(2)固定时间法 使反应准确地进行到某一固定的时刻t，立即测定F,得到F-c曲线cF(3)固定荧光强度法 测量荧光强度的变化值达到某一规定值所需的时间t，得到1/t-c 曲线。c1

20、/t荧光动力学分析法的优点：灵敏度高、选择性好、线性范围宽缺点：a.必须考虑基体中存在的某些荧光猝灭剂、内滤效应、能量转移和光化学反应等因素所可能造成的影响；b.荧光监测难以进行绝对测量 c.荧光测定比吸光度测定所需的仪器复杂与平衡态荧光测定相比：在较高的分析物浓度下仍能获得线性的响应，而且不受散射光和背景荧光的干扰。二、动力学分析仪器设备 1、一般荧光分光光度计 15s以上的慢反应 2、荧光计停流装置 15s以内的快反应 3、测定荧光反应速率的仪器三、荧光动力学法的分析应用 1、非催化法的应用示例（1）金属离子的测定 Al3+与8羟基喹啉5磺酸（2）有机物的测定 Trp+甲醛 荧光产物pH 10.82、酶催化法 酶是一种蛋白质，它是生物体的生物合成催化剂 水解酶 氧化还原酶例如：血清中-羟基丁酸脱氢酶（-HBD）和谷内转氨酶（GPT）的测定测-HBD-羟基丁酸盐NAD -丁酮酸盐NADH测GPTL-丙氨酸 -酮戊二酸 -丙酮酸L-戊二酸 丙酮酸+NADH+H+L-乳酸+NAD HBDGPTLDH(2)底物的测定 血清中葡萄糖的测定葡萄糖+ATP ADP葡糖-6-磷酸葡糖-6-磷酸NAD 6-磷酸葡糖酸+NADHHXG-6-PDH(3)活化剂或抑制剂的测定 Mg2+可活化异柠檬酸脱氢酶3、催化法 2，2二吡啶甲酮腙+H2O2Cu2+