临床分子诊断应用的发展和趋势.ppt

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1、临床分子诊断应用的临床分子诊断应用的进展和趋势进展和趋势卫生部临床检验中心 李金明分子诊断技术分子诊断技术l以DNA、RNA或蛋白为靶标，通过检测基因的存在、变异或表达从而为疾病的临床诊断提供直接和科学信息的技术。如分子杂交技术、分子杂交技术、PCR技术、测序技术、凝胶电泳技术、免疫测技术、测序技术、凝胶电泳技术、免疫测定技术定技术等。l基因：除了蛋白质或某些RNA的编码区外，还包括为获得一个特异性产物所必需的相关序列。几个里程碑几个里程碑l1953年:DNA双股螺旋的发现l1963年:放射免疫测定技术、核酸测序方法l19721973年:重组DNA技术l1983年:PCR测定技术l1991年:

2、实时荧光PCR技术和芯片技术l2000年：纳米和量子标记技术？核酸研究的历史核酸研究的历史l1953 沃森和克里克沃森和克里克（WATSON，CRICK）-DNA双螺旋双螺旋Francis Crick and James Watson(获获1962年诺贝尔生理学医学奖年诺贝尔生理学医学奖)核酸研究的历史核酸研究的历史 1960年代中期年代中期 桑格桑格(Sanger)的的DNA测序法测序法 Frederick Sanger(获获1958和和1980年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖)核酸研究的历史核酸研究的历史1983 穆利斯（穆利斯（Kary Mullis)PCR技术技术 1990 Human G

3、enome Project Kary Mullis (获获1993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖)后基因组时代后基因组时代-基因组学基因组学l功能基因组学功能基因组学 研究的核心问题有：基因研究的核心问题有：基因组的多样性（组的多样性（SNP、药物、药物基因组学基因组学）；基因组的表）；基因组的表达及其时空调节（达及其时空调节（基因芯基因芯片、微量片、微量RNA探针、蛋白探针、蛋白质组学质组学）；模式生物基因）；模式生物基因组研究（组研究（基因剔除基因剔除）等）等后基因组时代后基因组时代-基因组学基因组学l结构基因组学结构基因组学 结构基因组学，是由结构生物学与功能基因组结构基因组学，是由结构生

4、物学与功能基因组学紧密结合所产生的，其科学目标就是要规模学紧密结合所产生的，其科学目标就是要规模化地测定蛋白质、化地测定蛋白质、RNA及其它生物大分子的三及其它生物大分子的三维结构。维结构。临床临床PCRPCR检验的国内外现状检验的国内外现状l国外以前应用相对较少,主要为ROCHE的COBAS AMPLICORl国内从2002年开始规范化应用,以实时荧光PCR为主在感染性疾病病原体检测中的应用在感染性疾病病原体检测中的应用l病毒的检测病毒的检测 定量 定性 基因型及基因突变l细菌及其它微生物的检测细菌及其它微生物的检测 难培养菌 耐药基因l寄生虫的检测寄生虫的检测在遗传病及其它基因相关疾病在遗

5、传病及其它基因相关疾病诊断中的应用诊断中的应用l地贫l地贫l血友病l药物性耳聋在亲子鉴定中的应用在亲子鉴定中的应用l每个人的遗传物质一半来自父亲，另一半则来自母亲。根据孟德尔遗传分离和自由组合定律，亲代基因型决定子代基因型，在没有基因突变和分型错误的前提下，孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。l父系遗传的Y染色体的标记，子代的分型必定与父亲的相同，而且同一父系的所有个体的分型一致。母系遗传的线粒体DNA，子代的分型与母亲的分型一致，并且同一母系的所有个体的分型一致。在亲子鉴定中的应用在亲子鉴定中的应用l父与子之间仅有一个遗传标志不符合遗传规律尚不能排除亲子关系，因为有可能是突变所致。必须有2个

6、以上不同基因座同时不符才能否定其亲子关系。l亲子鉴定的手段主要有两大类:(1)血液中各种抗原成分的遗传多态性标志物检验,如人类白细胞抗原分型、红细胞抗原分型、红细胞酶型及血清型；（2）DNA多态性检验。主要包括有单基因座探针限制性片段长度多态性（DNA指纹）和单基因座扩增片段长度多态性（包括用多聚酶链反应(PCR)检测的可变数目串联重复多态性(VNTR)和短串联重复多态性(STR)）。在亲子鉴定中的应用在亲子鉴定中的应用lDNA多态性检验是目前亲子鉴定中最准确的一种方法。l如果孩子和被测试男子的DNA模式在两个或多个DNA探针上不吻合,那么被测试男子便被100%排除,即他是亲生父亲的可能性是0

7、%。反之，如果孩子和被测试父亲的DNA模式完全吻合,则在理论上不能100%肯定其为亲生父亲，只能计算出99.95%或更大的概率。l事实上也发生过DNA模式完全吻合但实际并非为生父的情况，但这种情况的可能性极低。在个体鉴别中的应用在个体鉴别中的应用l基因指纹又称DNA指纹，指的单基因座探针限制性片段长度多态性。DNA所含有的遗传信息是由遗传密码字母A、C、G和T的序列决定的。人类含有总数约30亿个这种字母，它们在人体每个细胞的染色体上都以一定的次序排列，排列次序的不同使得一个个体与另一个个体完全不同。个体间的亲缘关系相距越远，基因组的核苷酸字母排列差异就越大。相反，遗传上相关的个体（如同胞、父子

8、）相应地在其字母序列上有很大的相似性。在个体鉴别中的应用在个体鉴别中的应用lDNA指纹就是通过分析这种差异来确定个体。lDNA指纹是最可靠的个体确认方法，现已在司法实践中广泛应用，有很多案例的唯一证据就是留在现场的这些藏在细胞内的DNA。在恶性肿瘤诊断中的应用在恶性肿瘤诊断中的应用l肿瘤诊断l肿瘤疗效观察l肿瘤的转移在血液筛检中的应用在血液筛检中的应用lHCV和HIV感染“窗口期”lHBV DNA PCR检测筛检血液的意义其其 它它lImmuno-PCR临床分子诊断的标准化l方法试剂的标准化方法试剂的标准化 核酸提取 “内标”(Internal control)的应用l工作程序的标准化工作程序的标准化 标本采集、运送、管理、检测、质量控制、结果报告和解释l标准物质的研究标准物质的研究临床分子诊断应用的发展趋势临床分子诊断应用的发展趋势l核酸提取方法的简便化和自动化l项目的多样化：从病原体、到基因疾病的诊断、多标志物同时检测、疾病基因指纹l不同原理的检测方法和手段的普遍应用l扩增试剂的改进：标准化、防污染、有内标阴性质控l临床分子诊断实验室质量理念不断增强