土壤中分解尿素的细菌分离和计数.ppt

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1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数微生物的培养与应用细菌脲酶细菌脲酶尿素尿素CO(NHCO(NH2 2)2 2重要的农业氮肥。重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为只能被土壤中细菌分解为NHNH3 3才能被植物吸才能被植物吸收利用收利用 CO(NHCO(NH2 2)2 2+H+H2 2O COO CO2 2+2NH+2NH3 3课题背景课题背景课题目的课题目的土壤中尿素分解菌的分离与计数从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土样中究竟含有多少这样的细菌思考：思考：PCRPCR技术要求使用耐高温的技术要求使用耐高温的DNADNA聚合酶，聚合酶，这种酶

2、要能忍受这种酶要能忍受93 93 左右的高温。如果请你来寻找左右的高温。如果请你来寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？()A A土壤中土壤中 B B海水中海水中C C热泉中热泉中 D D冷库中冷库中C C如何寻找如何寻找耐高温耐高温的酶？的酶？寻找寻找高温高温环境；环境；原理：热泉原理：热泉70-8070-80的的高温条件淘汰了绝大多数高温条件淘汰了绝大多数的微生物，使得耐热的的微生物，使得耐热的TaqTaq细菌脱颖而出。选出细菌脱颖而出。选出耐高温细菌后，从耐高温菌种中提取耐高温酶。耐高温细菌后，从耐高温菌种中提取耐高温酶。1 1、自然界中目的菌株的刷选原理：

3、、自然界中目的菌株的刷选原理：一、筛选菌株一、筛选菌株2 2、实验室中筛选微生物的原理：、实验室中筛选微生物的原理：（纯且活的菌种纯且活的菌种）在寻找目的菌株时，要根据它对在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境生存环境的要求，的要求，到相应的环境中去找。到相应的环境中去找。人为提供人为提供有利于目的菌株生长的条件有利于目的菌株生长的条件(包括营养、包括营养、温度、温度、pHpH等等)，同时，同时抑制或阻止抑制或阻止其他微生物生长。其他微生物生长。KH KH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 4 H H2 2O 0.2g

4、O 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 琼脂琼脂 15.0g15.0g 将上述物质溶解后，将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到1000mL1000mL。该培养基的配方中，为微该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？分别是什么物质？此配方能否筛选出分解尿此配方能否筛选出分解尿素的细菌？为什么？素的细菌？为什么？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素氮源：氮源：尿素尿素能。只有产生脲酶的细菌能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生能利用尿素作为氮源而生存。存。3 3、方法：、方法：利用选择培养基分离

5、利用选择培养基分离选择培养基：选择培养基：允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。其他种类微生物生长的培养基。(1)(1)在培养基中在培养基中加入某种化学物质加入某种化学物质。利用选择培养基分离微生物的方法：利用选择培养基分离微生物的方法：例如，加入例如，加入青霉素青霉素可以分离出可以分离出 ；加入加入高浓度的食盐高浓度的食盐可以得到可以得到 。酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌这里的加入是在培养成分的基础上加入这里的加入是在培养成分的基础上加入。(2)(2)改变改变培养基中的培养基中的营养成分营养成分。例如

6、，缺乏例如，缺乏氮源氮源时可以分离时可以分离 ；尿素尿素作为作为唯一氮源唯一氮源时，可以分离出时，可以分离出 石油石油作为作为唯一碳源唯一碳源时，可以分离出时，可以分离出 固氮微生物固氮微生物能消除石油污染的微生物能消除石油污染的微生物能分解尿素的细菌能分解尿素的细菌(3)(3)改变改变微生物的微生物的培养条件培养条件。例如，将培养基放在例如，将培养基放在高温环境高温环境中培养可以得到中培养可以得到耐高温的微生物耐高温的微生物本课题使用的培养基的配方如下：本课题使用的培养基的配方如下：请分析后回答：请分析后回答：(1)(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和在该培养基的配方中，为微生

7、物的生长提供碳源和氮源的分别是氮源的分别是_和和_。(2)(2)该培养基为该培养基为_培养基培养基(按物理状态分按物理状态分)，理由是理由是_。(3)(3)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？果具有，又是如何进行选择的？_ _ _。葡萄糖葡萄糖尿素尿素固体固体有凝固剂琼脂有凝固剂琼脂有选择作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能有选择作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长够利用尿素的微生物才能够生长二、二、统计菌落数目统计菌落数目1 1、方法：、方法：常用稀释涂布平板法统计活菌的数

8、目常用稀释涂布平板法统计活菌的数目原理：原理：当样品的当样品的 时，培养基表面生长时，培养基表面生长的的一个菌落一个菌落来源于样品稀释液中的来源于样品稀释液中的 。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在 统计统计通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少的活菌。中大约含有多少的活菌。要求：要求：3030 300 300 个菌落的平板个菌落的平板稀释度足够高稀释度足够高一个活菌一个活菌 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为样品中的细菌数。从对应

9、稀释倍数为10106 6的培养基中，的培养基中，得到以下两种统计结果。得到以下两种统计结果。1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为落数为230230。2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，统三个平板，统计的菌落数分别为计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三个平板，该同学以这三个平板上菌落数的平均值上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？错在哪？甲：没有甲：

10、没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板）乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值 用用稀稀释释涂涂布布平平板板法法测测定定同同一一土土壤壤样样品品中中的的细细菌菌数数，在在对对应应稀稀释释倍倍数数为为10106 6的的培培养养基基中中，得得到到以下几种统计结果，正确的是以下几种统计结果，正确的是()A A涂布了一个平板，统计的菌落数是涂布了一个平板，统计的菌落数是230230B B涂涂布布了了两两个个平平板板，统统计计的的菌菌落落数数是是215215和和260260，取平均值，取平均值238238C C涂涂布布了了三三个个平平板板

11、，统统计计的的菌菌落落数数分分别别是是2121、212212和和256256，取平均值，取平均值163163D D涂涂布布了了三三个个平平板板，统统计计的的菌菌落落数数分分别别是是210210、240240和和250250，取平均值，取平均值233233因为因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。观察到的只是一个菌落。因此统计结果一般用因此统计结果一般用菌落数菌落数表示。表示。=（平均菌落数（平均菌落数涂布的稀释液体积）涂布的稀释液体积）稀释倍数稀释倍数 。缺点：缺点：操作复杂，实验结果有一定的误差。操作复杂，实验结果有一定的误差。统计的菌

12、落数往往比活菌的实际数目低统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（C/V)X MC/V)X MC:C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:V:所用稀释液的体积；所用稀释液的体积；M:M:稀释倍数。稀释倍数。计算计算公式：公式：显微镜直接计数显微镜直接计数 优点：优点：缺点：缺点：计数方便，操作简单计数方便，操作简单死菌、活菌都计算在内，死菌、活菌都计算在内，统计结果比实际值偏大统计结果比实际值偏大（统计菌株数目）（统计菌株数目）1、产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（、产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养

13、基分别是（）A一个细菌、液体培养基一个细菌、液体培养基B许多细菌、液体培养基许多细菌、液体培养基C一个细菌、固体培养基一个细菌、固体培养基D许多细菌、固体培养基许多细菌、固体培养基2、某同学在稀释倍数为、某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为的平均值为215，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为稀释液的体积为0.1ml）A2.15108B2.15109C215D21.53、下列有关检测土壤中细菌总数实验操作的叙述中，、下列有关检测土壤中细菌总数实验操作的叙述中，不正确的是（不正确的是

14、（）A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板B取取104、105、106倍土壤稀释液和无菌水各倍土壤稀释液和无菌水各0.1ml涂布不同平板涂布不同平板C将实验组和对照组平板倒置，将实验组和对照组平板倒置，37恒温培养恒温培养24h-48hD确定对照组无菌后，选择菌落数在确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数。以上的平板进行计数。CBD 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，的培养基中，A A、B B两同学分别两同学分别

15、得到以下两种统计结果。得到以下两种统计结果。1 1、A A同学筛选出同学筛选出150150个菌落。个菌落。2 2、B B同学筛选出同学筛选出5050个菌落。个菌落。B B认为认为A A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。在该培养基中生长。A A确认自己的操作无误，但也拿确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。不出能令人信服的证据。请你帮助请你帮助A A同学改进实验，提供具有说明了的证同学改进实验，提供具有说明了的证据。据。方案方案1 1：其他

16、同学用：其他同学用A A同学的土样进行实验。同学的土样进行实验。方案方案2 2：A A同学以不接种的培养基作为空白对照同学以不接种的培养基作为空白对照。2 2、增加实验说服力的措施、增加实验说服力的措施：排除实验组中排除实验组中非测试因素非测试因素对实验结果对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。的影响，提高实验结果的可信度。设置重复：设置重复：排除排除偶然因素偶然因素对实验结果的影响。对实验结果的影响。在培养过程中在培养过程中同一稀释度下同一稀释度下应应涂布涂布至少至少3个平板个平板，才能增强说服力和准确性，才能增强说服力和准确性设置对照：设置对照：若对照的培养皿中无菌落生长，说明：若对照的

17、培养皿中无菌落生长，说明：方法：方法：方法：方法：观察培养物中是否有杂菌污染观察培养物中是否有杂菌污染如如空白对照组空白对照组培养基未被杂菌感染培养基未被杂菌感染培养基混入其他杂菌培养基混入其他杂菌若实验的培养基菌落数偏高或者菌落形态多样，说明：若实验的培养基菌落数偏高或者菌落形态多样，说明：若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目，说明：上的数目，说明：观察选择培养物是否具有观察选择培养物是否具有选择作用选择作用如如完全培养基对照组完全培养基对照组选择培养基具有筛选作用选择培养基具有筛选作用距地表约距地表约3 3 8cm8cm土壤层土壤

18、层菌落计数菌落计数配制土壤溶配制土壤溶液液系列稀释系列稀释涂布平板与培涂布平板与培养养三、实验设计三、实验设计1 1、实验流程：、实验流程：2 2、操作流程：、操作流程：（1 1）土壤取样）土壤取样取样原因：取样原因：土壤要求：土壤要求：取样部位：取样部位：土壤土壤“微生物的天然培养基微生物的天然培养基”，含有大量，含有大量的微生物，数量最大，种类最多。的微生物，数量最大，种类最多。富含富含有机质有机质，pHpH接近接近中性中性且且潮湿潮湿。测细菌数：测细菌数：测放线菌：测放线菌：测真菌数：测真菌数：（2 2）样品稀释）样品稀释稀释原因：稀释原因：稀释标准：稀释标准：稀释倍数：稀释倍数：样品的

19、稀释程度样品的稀释程度直接影响平板上生长的直接影响平板上生长的菌落数目菌落数目选用一定稀释范围的样品液进行培养，选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得保证获得菌落数在菌落数在30-30030-300之间之间，便于计数。，便于计数。一般用一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液一般用一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液一般用一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？土壤中各类微生物的数量不同土壤中各类微生物的数量不同如果是第一次

20、做这个实验，稀释倍数的范围如果是第一次做这个实验，稀释倍数的范围可以放宽可以放宽103-107.1、关于土壤取样的叙述，错误的是（、关于土壤取样的叙述，错误的是（）A土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤B先铲去表层土先铲去表层土3-8cm左右，再取样左右，再取样C取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤2、下列关于、下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离土壤中分解尿素的细菌的分离”实验步骤排列实验步骤排列正确的是正确的是土壤取样土壤取样称取称取10g土壤加入盛有土壤加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中无

21、菌水的锥形瓶中吸取吸取0.1ml进行平板涂布进行平板涂布依次稀释至依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度稀释度ABCDCC（三）微生物的培养与观察（三）微生物的培养与观察 1 1、接种：用适当的稀释液涂布平板、接种：用适当的稀释液涂布平板 2 2、培养：细菌：、培养：细菌：3030 3737，1 1 2d;2d;放线菌放线菌:25:25 28,528,5 7d;7d;霉菌霉菌:25:25 28,328,3 4d.4d.3 3、观察：、观察：a.a.每每24h24h统计一次菌落数目统计一次菌落数目 b.b.以以“稳定稳定菌落菌落”为观察对象为观察对象 （四）鉴定：

22、筛选后必鉴定（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物的生存鉴别培养基：不影响微生物的生存酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：原理：脲酶催化尿素分解成氨脲酶催化尿素分解成氨培养基培养基碱性增强碱性增强 酚红变红酚红变红为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板

23、先行培养了涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是一段时间，这样做的目的是；然后，将水样稀释然后，将水样稀释100倍，在倍，在3个平板上用涂布法分别接个平板上用涂布法分别接入稀释液；经适当培养后，入稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为个平板上的菌落数分别为39、38和和37，据此可得出每升水样中的活菌数为，据此可得出每升水样中的活菌数为。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过接种环通过灭菌，在第二次及以后的划线时，灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的

24、目的是总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是。(3)示意图示意图A和和B中中,表示的是用稀释涂布平表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现:振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中因是：振荡培养能提高培养液中的含量，同时的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高可使菌体与培养液充分接触，提高的利用率。的利用率。