第六章微生物的生长与控制ppt.ppt
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1、第六章 微生物的生长与控制【知识目标知识目标知识目标知识目标】1.了解微生物生长的概念。2.理解环境条件对微生物生长的影响和控制方法,工业上常用的微生物培养技术。3.掌握几种常用的微生物生长量的测定方法,微生物的生长曲线及对生产实践的指导意义,微生物的诱变育种和常用的微生物菌种保藏的方法。【技能目标技能目标技能目标技能目标】1.能够运用微生物生长量的相关理论知识,完成微生物生长量的测定。2.能够运用微生物生长规律的相关理论知识,完成微生物生长曲线的绘制,并学会如何运用微生物的生长曲线来指导生产实践。3.能够运用微生物菌种保藏的相关知识,完成生产菌种的保藏工作。第一节第一节 微生物的生长微生物的
2、生长一、微生物生长的概念一、微生物生长的概念一、微生物生长的概念一、微生物生长的概念n n微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加,导致细胞体积增大的微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加,导致细胞体积增大的生物学过程,这是微生物个体生长的定义。生物学过程,这是微生物个体生长的定义。n n当微生物生长到一定阶段,由于细胞结构的复制与重建并通过特定方当微生物生长到一定阶段,由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体,即引起个体数量增加,这是微生物的繁殖。式产生新的生命个体,即引起个体数量增加,这是微生物的繁殖。n n由于微生物个体微小,生长与繁殖这两个过程是紧密联系又很难划分由于微
3、生物个体微小,生长与繁殖这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。因此在讨论微生物生长时,往往将这两个过程放在一起讨论,的过程。因此在讨论微生物生长时,往往将这两个过程放在一起讨论,这样微生物生长又可以定义为在一定时间和条件下细胞数量的增加,这样微生物生长又可以定义为在一定时间和条件下细胞数量的增加,这是微生物群体生长的定义。这是微生物群体生长的定义。二、微生物生长量的测定二、微生物生长量的测定(一)微生物细胞数目的测定方法(一)微生物细胞数目的测定方法1 1细胞总数计数法细胞总数计数法 细胞总数计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种细胞总数计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般包括
4、显微镜直接计数法、涂片计数法和比浊法。方法。一般包括显微镜直接计数法、涂片计数法和比浊法。n n (1 1)显微镜直接计数法)显微镜直接计数法 这类方法是利用特定的血球计数板,在显微镜下计算一定容这类方法是利用特定的血球计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。图6-1血球计数板和血球计数板计数网的分区和分格血球计数板是一块特制的载玻片(如图6-1),上面有特定面积(1mm2)和高度(0.1mm)的计数室,在1mm2的面积里又被刻划成25个(或16个)中格,每个中格进一步划分成16个(或25个)小格,
5、但整个计数室都是由400个小格组成。n n将稀释的样品滴在计数板上,盖上盖玻片,然后在显微镜将稀释的样品滴在计数板上,盖上盖玻片,然后在显微镜下计算下计算4 45 5个中格的菌体总数,并求出每个小格所含菌体个中格的菌体总数,并求出每个小格所含菌体的平均数,再按下面公式求出每毫升样品所含的菌体数。的平均数,再按下面公式求出每毫升样品所含的菌体数。n n(2 2)涂片计数法)涂片计数法 用计数板附带的用计数板附带的0.01mL0.01mL吸管,吸取定量稀释的细菌悬液,放置刻有吸管,吸取定量稀释的细菌悬液,放置刻有1cm1cm2 2面积的玻片上,使菌液均匀地涂布在面积的玻片上,使菌液均匀地涂布在1c
6、m1cm2 2面积上,固定后染色,在显微面积上,固定后染色,在显微镜下任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞数量。根据计算出的视野面镜下任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞数量。根据计算出的视野面积核算出积核算出1cm1cm2 2中的菌数,然后按中的菌数,然后按1cm1cm2 2面积上的菌液量和稀释度,计算每面积上的菌液量和稀释度,计算每毫升原液中的含菌数。毫升原液中的含菌数。每毫升原菌液的含菌数视野中的平均菌数1cm2/视野面积100稀释倍数n n(3 3)比浊法)比浊法 比浊法是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌比浊法是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中的细胞浓度与混浊
7、度成正比,与透光度成反比。细悬液中的细胞浓度与混浊度成正比,与透光度成反比。细胞越多,浊度越大,透光量越少。因此,测定菌悬液的光胞越多,浊度越大,透光量越少。因此,测定菌悬液的光密度(或透光度)可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的密度(或透光度)可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的菌悬液与已知细胞数的菌悬液相比,求出未知菌悬液所含菌悬液与已知细胞数的菌悬液相比,求出未知菌悬液所含的细胞数。浊度计、分光光度仪是测定菌悬液细胞浓度的的细胞数。浊度计、分光光度仪是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器(如图常用仪器(如图6-26-2)。)。图6-2 比浊法此法比较简便,但使用有局限性。此法比较简便,但使用有局限性
8、。菌悬液颜色不宜太深,不能混杂其菌悬液颜色不宜太深,不能混杂其他物质,否则不能获得正确结果。他物质,否则不能获得正确结果。2 2活菌计数法活菌计数法 活菌计数法是通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌计数法是通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌数的方法,故又称平板计数法(如图活菌数的方法,故又称平板计数法(如图6-36-3)。活菌计数法的特点)。活菌计数法的特点是计算的结果是活菌落。在进行活菌计数时要注意样品的稀释度,保是计算的结果是活菌落。在进行活菌计数时要注意样品的稀释度,保证一个活细胞可形成一个菌落。证一个活细胞可形成一个菌落。(1 1)涂布平板法)涂布平板法
9、用灭菌的涂布器将一定体积(不大于用灭菌的涂布器将一定体积(不大于0.1mL0.1mL)适当稀释度的菌液涂布)适当稀释度的菌液涂布在琼脂培养基的表面,然后保温培养到有菌落出现,记录菌落的数目在琼脂培养基的表面,然后保温培养到有菌落出现,记录菌落的数目并换算成每毫升试样中的活细胞数量。并换算成每毫升试样中的活细胞数量。(2 2)倒平板法)倒平板法 将样品稀释到一定浓度,取一定体积(将样品稀释到一定浓度,取一定体积(0.1mL0.1mL1mL1mL)倒入冷却至)倒入冷却至4545的固体培养基中混合,然后倒入无菌平皿中制成平板,培养后出的固体培养基中混合,然后倒入无菌平皿中制成平板,培养后出现菌落,由
10、菌落数推算出活菌总数。现菌落,由菌落数推算出活菌总数。(3 3)滤膜过滤法)滤膜过滤法当待测样品中菌数很低时,可以将样品通过膜过滤器(如图当待测样品中菌数很低时,可以将样品通过膜过滤器(如图6-46-4),然),然后将膜转到相应的培养基上进行培养,对形成的菌落进行统计。后将膜转到相应的培养基上进行培养,对形成的菌落进行统计。图6-4滤膜过滤法测定微生物生长的相关生理指标,也可以间接的反应出微生物的生长量,测定微生物生长的相关生理指标,也可以间接的反应出微生物的生长量,常用以下方法来测定。常用以下方法来测定。1 1重量法重量法此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、此法的
11、原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长量的测定。多细胞以及丝状体微生物生长量的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来,经洗涤,离心后直将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来,经洗涤,离心后直接称重,求出湿重。如果是丝状体微生物,过滤后用滤纸吸去菌丝之间接称重,求出湿重。如果是丝状体微生物,过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水,再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品,可以将的自由水,再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品,可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内,于它们放在已知重量的平皿或烧杯内,于105105烘干至恒重,取出放
12、入干烘干至恒重,取出放入干燥器内冷却,再称量,求出微生物干重。一般说来,干重为湿重的燥器内冷却,再称量,求出微生物干重。一般说来,干重为湿重的10%10%20%20%。(二)微生物生理指标的测定方法(二)微生物生理指标的测定方法2 2体积测量法体积测量法体积测量法又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积体积测量法又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。具体方法是取一定量的待测培养液(如具体方法是取一定量的待测培养液(如10mL10mL)放)放在有刻度的离心管中(如图在有刻度的离心管中(如图6-56-5),设定一定的离)
13、,设定一定的离心时间(如心时间(如5min5min)和转速(如)和转速(如5000rpm5000rpm),离),离心后,倒出上清液,测出上清液体积为心后,倒出上清液,测出上清液体积为V V,则菌丝,则菌丝浓度为(浓度为(10-V10-V)/10/10。菌丝浓度测定法是大规模。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产中测定微生物生长量的一个重要监测工业发酵生产中测定微生物生长量的一个重要监测指标。这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设指标。这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设定一致的处理条件,否则偏差很大,由于离心沉淀定一致的处理条件,否则偏差很大,由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物,结果会有一定
14、偏差。物中夹杂有一些固体营养物,结果会有一定偏差。图6-5刻度离心管3 3测定菌种细胞内化学成分测定菌种细胞内化学成分测定菌种细胞内化学成分的方法较复杂,操作困难,但较准确,菌种测定菌种细胞内化学成分的方法较复杂,操作困难,但较准确,菌种细胞内化学成分的多少,可反映出群体中菌体数量的多少。细胞内化学成分的多少,可反映出群体中菌体数量的多少。(1 1)测定含氮量)测定含氮量微生物细胞的含氮量一般比较稳定,所以常作为生长量的指标,大多微生物细胞的含氮量一般比较稳定,所以常作为生长量的指标,大多数细菌的含氮量为其干重的数细菌的含氮量为其干重的12.512.5,酵母菌为,酵母菌为7.57.5,霉菌为,
15、霉菌为6.06.0。根据其含氮量再乘以根据其含氮量再乘以6.256.25,即可测得其粗蛋白的含量(包括了杂环氮,即可测得其粗蛋白的含量(包括了杂环氮和氧化型氮)。细菌中蛋白质含量占细菌固形物的和氧化型氮)。细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50%50%80%80%,一般,一般以以65%65%为代表,因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式为代表,因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算:计算:(2 2)氨基氮的测定)氨基氮的测定 具体方法是离心发酵液,取上清液,加入甲基红和盐酸作指示剂,加具体方法是离心发酵液,取上清液,加入甲基红和盐酸作指示剂,加入入0.02N0.02N的的NaO
16、HNaOH调色至颜色刚刚褪去,加入上清液调色至颜色刚刚褪去,加入上清液18%18%的中性甲醛,反的中性甲醛,反应片刻,加入应片刻,加入0.02N0.02N的的NaOHNaOH使之变色,根据使之变色,根据NaOHNaOH的用量折算出氨基氮的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量,可间接反映微生物的生长状况。的含量。根据培养液中氨基氮的含量,可间接反映微生物的生长状况。(3 3)其他生理物质的测定)其他生理物质的测定 P P、DNADNA、RNARNA、ATPATP、NAMNAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸、产气、(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸、产气、产产COCO2 2(用标记葡萄糖做基质
17、)、耗氧、黏度、产热等指标,都可用于生(用标记葡萄糖做基质)、耗氧、黏度、产热等指标,都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化、最终产气量、微生物长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化、最终产气量、微生物活性等方面的测定反映微生物的生长。活性等方面的测定反映微生物的生长。(4 4)商业化快速微生物检测法)商业化快速微生物检测法微生物检测的发展方向是快速、准微生物检测的发展方向是快速、准确、简便、自动化,当前很多生物确、简便、自动化,当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理,制品公司利用传统微生物检测原理,结合不同的检测方法,设计了形式结合不同的检测方法,设计了形式各异的微
18、生物检测仪器设备,这些各异的微生物检测仪器设备,这些仪器设备正逐步应用于医学微生物仪器设备正逐步应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如全自动检测和科学研究领域。例如全自动微生物快速检测系统(如图微生物快速检测系统(如图6-66-6)可)可以在数小时内获得监测结果,样本以在数小时内获得监测结果,样本颜色及光学特征都不影响读数,对颜色及光学特征都不影响读数,对酵母菌和霉菌检测同样具有高度敏酵母菌和霉菌检测同样具有高度敏感。感。图6-6全自动微生物快速检测系统 对于丝状微生物,特别是丝状真对于丝状微生物,特别是丝状真菌,通常是通过测定菌丝的长度变菌,通常是通过测定菌丝的长度变化来反映它们的生长速率
19、,主要采化来反映它们的生长速率,主要采用的有如下几种方法。用的有如下几种方法。1 1培养基表面菌体生长速率测培养基表面菌体生长速率测定法定法 培养基表面菌体生长速率测定法主培养基表面菌体生长速率测定法主要测定一定时间内在琼脂培养基表要测定一定时间内在琼脂培养基表面菌落直径的增加值。一般采用载面菌落直径的增加值。一般采用载玻片培养法,方法如图玻片培养法,方法如图6-76-7。图6-7载玻片培养法(三)菌丝长度的测定方法2 2培养料中菌体生长速率测定法培养料中菌体生长速率测定法 主要测定一定时间内在固体培养料中菌丝体向主要测定一定时间内在固体培养料中菌丝体向前延伸的距离。这种方法常用于食用菌菌丝体
20、前延伸的距离。这种方法常用于食用菌菌丝体生长速率的测定。生长速率的测定。3 3单个菌丝顶端生长速率测定法单个菌丝顶端生长速率测定法具体操作是将待测菌株点植接种于培养基平板具体操作是将待测菌株点植接种于培养基平板的中心,生长一定时间后,将平板置于显微镜的中心,生长一定时间后,将平板置于显微镜载物台上,同时校对所用显微镜的目镜测微尺,载物台上,同时校对所用显微镜的目镜测微尺,并计算每一格的长度。在菌落边缘选择单根菌并计算每一格的长度。在菌落边缘选择单根菌丝的顶端在低倍镜下聚焦。然后将目镜测微尺丝的顶端在低倍镜下聚焦。然后将目镜测微尺与菌丝平行,并选择菌丝开始出现侧枝的部位与菌丝平行,并选择菌丝开始
21、出现侧枝的部位与目镜测微尺上的一条刻度线重合,这个点即与目镜测微尺上的一条刻度线重合,这个点即为为“参照点参照点”,每隔一定时间测量一次菌丝生,每隔一定时间测量一次菌丝生长的长度。长的长度。图6-8霉菌菌丝生长(图中的数字为分钟)第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 研究微生物的生长规律,需要从研究微生物的个体生研究微生物的生长规律,需要从研究微生物的个体生长和群体生长两个方面着手。长和群体生长两个方面着手。一、微生物的个体生长和同步生长一、微生物的个体生长和同步生长一、微生物的个体生长和同步生长一、微生物的个体生长和同步生长 以细菌为例介绍微生物的个体生长和同步生长。以细菌为例介绍
22、微生物的个体生长和同步生长。目前对细菌的个体生长进行研究主要有两种方法。目前对细菌的个体生长进行研究主要有两种方法。n n一是利用电子显微镜观察细胞的超薄切片;一是利用电子显微镜观察细胞的超薄切片;n n二是采用同步培养方法。二是采用同步培养方法。n n同步培养能使群体中处于个体生长的不同阶段细同步培养能使群体中处于个体生长的不同阶段细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。n n以同步培养方法使群体细胞能够处于同一生长阶以同步培养方法使群体细胞能够处于同一生长阶段,并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。段,并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。n n同
23、步培养细胞常被用来研究在单个细胞上难以研同步培养细胞常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子,它究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子,它是一种理想的材料。是一种理想的材料。同步培养方法很多,可归纳为同步培养方法很多,可归纳为机械法与环境条件控制法两类。机械法与环境条件控制法两类。1 1机械法机械法 这是一类根据微生物细胞在这是一类根据微生物细胞在不同生长阶段的细胞体积和质不同生长阶段的细胞体积和质量不同或根据它们同某种材料量不同或根据它们同某种材料结合不同的原理设计出来的方结合不同的原理设计出来的方法。其中常用的有以下几种方法。其中常用的有以下几种方法。法。n n
24、(1 1)离心方法)离心方法 n n(2 2)过滤分离法)过滤分离法n n(3 3)硝酸纤维素滤膜法)硝酸纤维素滤膜法图6-9机械法获得细胞同步培养a、硝酸纤维素滤膜法b、离心法2 2环境条件控制技术环境条件控制技术n n这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原理设计的一类获得同步这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原理设计的一类获得同步细胞的方法。细胞的方法。n n (1 1)温度:最适生长温度有利于细菌生长与分裂,不适宜温度如低温不利于)温度:最适生长温度有利于细菌生长与分裂,不适宜温度如低温不利于细菌生长与分裂。通过适宜与不适宜温度的交替处理之后,通过培养可获得同步
25、细菌生长与分裂。通过适宜与不适宜温度的交替处理之后,通过培养可获得同步细胞。细胞。n n (2 2)培养基成分控制:培养基中的碳、氮源或生长因子不足,可导致细菌缓)培养基成分控制:培养基中的碳、氮源或生长因子不足,可导致细菌缓慢生长直至生长停止。因此将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间,慢生长直至生长停止。因此将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间,然后转移到营养丰富的培养基里培养,能获得同步细胞。另外也可以将不同步的然后转移到营养丰富的培养基里培养,能获得同步细胞。另外也可以将不同步的细胞转接到含有一定浓度的、能抑制蛋白质等生物大分子合成的化学物质如抗生细胞转接到含有一定浓度的
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