23分解纤维素的微生物的分离.ppt

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1、亚麻亚麻棉花棉花教学目标教学目标:1、知道、知道纤维素酶纤维素酶的种类及作用的种类及作用2、初步掌握从土壤中、初步掌握从土壤中分离出分解纤维分离出分解纤维 素的微生物素的微生物的实验方法的实验方法1、纤维素、纤维素（1）组成）组成纤维素是由纤维素是由C、H、O三种元素构成，单体是葡萄糖，三种元素构成，单体是葡萄糖，分子通式为（分子通式为（C6H10O5）n，是地球上，是地球上含量最丰富的含量最丰富的多糖类物质。多糖类物质。（2）分布）分布植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中其中棉花棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。是自然界中纤维素含量最

2、高的天然产物。一、纤维素和纤维素酶一、纤维素和纤维素酶（3）性质）性质白色无味的纤维状结构物质，不溶于水，也不溶于一白色无味的纤维状结构物质，不溶于水，也不溶于一般的有机溶剂。不具备还原性，但能进行水解反应产般的有机溶剂。不具备还原性，但能进行水解反应产生葡萄糖。生葡萄糖。1、纤维素、纤维素（4）用途）用途用于造纸、纺织；食物中的膳食纤维可刺激肠胃蠕动、用于造纸、纺织；食物中的膳食纤维可刺激肠胃蠕动、促进消化的功能。促进消化的功能。2、纤维素酶的组成及作用、纤维素酶的组成及作用（1）组分：）组分：纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般认为它至少包括三，一般认为它至少包括三种组分，即种组

3、分，即CX酶酶、C1酶酶和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶一、纤维素和纤维素酶一、纤维素和纤维素酶（2）作用：）作用：纤维素纤维素 纤维二糖纤维二糖C1酶酶CX酶酶葡萄糖葡萄糖葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶（3）实验验证纤维素酶的作用）实验验证纤维素酶的作用实验组：实验组：放入放入1cm6cm的的滤纸条滤纸条加入加入pH为为4.8、物、物质的量浓度为质的量浓度为0.1mol/L的的醋酸醋酸醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液10ml、1ml纤维素纤维素酶酶（7080U/mL）固定在固定在50mL的锥形瓶中，的锥形瓶中，在摇床上振荡在摇床上振荡（140r/min，1h）（3）实验验证纤维素酶的作用）实验验证纤维素酶的作用对照组

4、：对照组：放入放入1cm6cm的的滤纸条滤纸条加入加入pH为为4.8、物、物质的量浓度为质的量浓度为0.1mol/L的的醋酸醋酸醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液11mL固定在固定在50mL的锥形瓶中，的锥形瓶中，在摇床上振荡在摇床上振荡（140r/min，1h）实验现象：实验现象：实验组中的滤纸条被分解，对照组中的滤纸条基本不变化。实验组中的滤纸条被分解，对照组中的滤纸条基本不变化。结论：结论：纤维素酶能分解纤维素。纤维素酶能分解纤维素。二、纤维素分解菌的筛选二、纤维素分解菌的筛选1、纤维素分解菌的筛选方法、纤维素分解菌的筛选方法2、纤维素分解菌的筛选方法的原理、纤维素分解菌的筛选方法的原理刚果红（刚

5、果红（CR）染色法）染色法：纤维素纤维素+刚果红刚果红 红色复合物红色复合物 刚果红是一种染料，它可以与刚果红是一种染料，它可以与纤维素纤维素形成红色复合物，形成红色复合物，但并不和但并不和纤维二糖纤维二糖、葡萄糖葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后维素酶分解后,刚果红刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的基中会出现以纤维素分解菌为中心的 。这样。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌纤维素分解菌透明圈透明圈 三、实验操作三、实验操作土壤取样土壤取样选择培养选

6、择培养梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上素分解菌的培养基上挑选产生透明挑选产生透明圈的菌落圈的菌落单菌落挑取法单菌落挑取法1、土壤取样土壤取样取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？选择纤维素丰富的环境选择纤维素丰富的环境，如树林中多年，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。用无菌小铁铲铲去表层土，迅速铲取土壤装用无菌小铁铲铲去表层土，迅速铲取土壤装入无菌信封密封。入无菌信封密封。选择培养基选择培养基纤维素分解菌的选择培养基纤维素分解菌的选择培养基纤

7、维素粉纤维素粉 5g5gNaNONaNO3 3 1g 1gNaNa2 2HPOHPO4 47H7H2 2O 0.5gO 0.5gKHKH2 2POPO4 4 0.9g 0.9gMgSOMgSO4 47H7H2 2O 0.5gO 0.5gKClKCl 0.5g 0.5g酵母膏酵母膏 0.5g0.5g水解酪素水解酪素 0.5g0.5g将上述物质溶解后将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到1000ml1000ml2 2、选择培养选择培养（1 1）选择培养的目的：选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物所需要

8、的微生物(富集培养，浓缩）富集培养，浓缩）（2 2）制备选择培养基制备选择培养基a a、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？b b、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具 有，是有，是如何进行选择的？如何进行选择的？c c、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用是是液体液体培养基，原因是配方中培养基，原因是配方中无凝固剂无凝固剂有选择作用，本配方中的有选择作用，本配方中的碳源是纤维素碳源是纤维素，所以，所以能分解能分解纤维素的微生物纤

9、维素的微生物可以可以大量繁殖大量繁殖用用牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基与之对照与之对照（3 3）操作方法：操作方法：称取土样称取土样20g20g 加入装有加入装有30mL30mL选择培养基选择培养基的锥形瓶中的锥形瓶中 将锥形瓶固定在摇床上将锥形瓶固定在摇床上 培养液变浑浊培养液变浑浊 吸取一定量培养液（如吸取一定量培养液（如5mL5mL）转移至另一瓶新鲜的培养基中转移至另一瓶新鲜的培养基中 摇床上振荡培养摇床上振荡培养 培养液变浑浊。培养液变浑浊。无菌条件下无菌条件下30，培养，培养12d3、梯度稀释梯度稀释用移液管从富用移液管从富集培养土壤液集培养土壤液(选择培养后的选择培养后的培养

10、基培养基)中吸取中吸取1ml1ml加入盛有加入盛有9ml9ml无菌水的试无菌水的试管中充分混匀。管中充分混匀。以此类推以此类推制成制成1010-1-1,10,10-2-2,10,10-3 3,10,10-4-4,10,10-5-5,10,10-6 6不同稀释度的不同稀释度的溶液。稀释最溶液。稀释最大倍数到大倍数到10106 64、涂布培养、涂布培养（1 1）制备培养基（固体培养基）制备培养基（固体培养基）（2 2）涂布平板：将稀释度为涂布平板：将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml0.1ml涂布在培养基上，涂布在培养基上，30303737培养培养1 12d2d

11、，每隔，每隔24h24h观察菌落生长情况。观察菌落生长情况。鉴别鉴别纤维素分解菌的纤维素分解菌的培养基培养基CMC-Na CMC-Na 5-10g 5-10g酵母膏酵母膏 1g1gKHKH2 2POPO4 4 0.25g 0.25g琼脂琼脂 15g15g土豆汁土豆汁 100ml100ml将上述物质溶解后将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到1000ml1000ml5、挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落参照刚果红染色法，参照刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，挑选产生透明圈的菌落，一一般般即为分解纤维素的菌落即为分解纤维素的菌落 空白组空白组实验组实验组刚果红染色法具体操作方法刚果

12、红染色法具体操作方法方法一：方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应方法二：方法二：在倒平板时就加入刚果红在倒平板时就加入刚果红培养基长出菌落培养基长出菌落加入加入CR溶液溶液培养培养1015min，倒掉，倒掉CR溶液溶液加入加入NaCl溶液，培养溶液，培养15min倒掉倒掉aCl溶液溶液产生透产生透明圈明圈配制配制CR溶液溶液灭菌灭菌按照每按照每200mL培养基中加入培养基中加入1mL的的CR配比混匀配比混匀倒平板倒平板培养培养出现出现透明圈透明圈方法方法先培养微生物，再加入刚先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应果红进行颜色反应在倒平板时就加入在

13、倒平板时就加入刚果红刚果红优点优点显示出的颜色反应基本上显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用是纤维素分解菌的作用操作简便，不存在操作简便，不存在菌落混在现象菌落混在现象缺点缺点操作繁琐，操作繁琐，加入刚果红会加入刚果红会使菌落之间发生混杂使菌落之间发生混杂由于纤维素粉、土豆由于纤维素粉、土豆汁中都含有淀粉，产生汁中都含有淀粉，产生淀粉酶的微生物也能形淀粉酶的微生物也能形成透明圈，即成透明圈，即假阳性反假阳性反应应；有些微生物具有些微生物具有有降解色素的能力降解色素的能力，长时，长时间的培养过程中会降解间的培养过程中会降解刚果红而形成明显的透刚果红而形成明显的透明圈。明圈。比较这两种方法各

14、有哪些优点与不足比较这两种方法各有哪些优点与不足四、结果分析与评价四、结果分析与评价1 1、培养基的制作是否合格？以及选择培养基是否培养基的制作是否合格？以及选择培养基是否筛选出菌落筛选出菌落设置对照，若设置对照，若对照的培养基对照的培养基在培养过程中在培养过程中无菌落无菌落生长则说明培养基制作合格。生长则说明培养基制作合格。如果观察到如果观察到产生透明圈的菌落产生透明圈的菌落，则说明可，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。能获得了分解纤维素的微生物。五、课题延伸五、课题延伸 本课题对分解纤维素的微生物进行了初本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。步的筛选，但

15、是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵发酵产纤维素酶产纤维素酶的实验。的实验。纤维素酶的发酵方法有纤维素酶的发酵方法有液体发酵液体发酵和和固体发酵固体发酵两种。两种。纤维素酶的纤维素酶的测定方法测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定葡萄糖进行定量的测定。斐林试剂斐林试剂 砖红色沉淀砖红色沉淀划线分离划线分离用接种环挑取菌落在鉴别培养基平板上作用接种环挑取菌落在鉴别培养基平板上作平板划线平板划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养，至长出单划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养，至长出单菌落。菌落。由此，即由此，即从土壤中分离纯化出纤维素分解菌从土壤中分离纯化出纤维素分解菌。纯化出纤维素分解菌纯化出纤维素分解菌