生物技术制药技术强悍总结.pdf

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1、动物细胞工程制药细胞工程：是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学大等理论和技术，有目的地进行精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。离体培养的细胞分为贴壁细胞、悬浮细胞和兼性贴壁细胞贴壁细胞的形态：成纤维细胞型、上皮样细胞型、游走细胞型、多形细胞型动物细胞的生理特点：1.细胞分裂周期长2.细胞生长需贴附基质，并有接触以直线向3.正常二倍体细胞的生长寿命是有限的4.动物细胞对周围环境十分敏感5.动物细胞对培养基的要求高6.动物细胞的合成途

2、径和修饰功能与细菌不同用于生产的动物细胞：原代细胞、二倍体细胞系、转化细胞系（可无限期传代）、融合细胞系原代细胞是直接取自动物组织、器官、经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。二倍体细胞系是指原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种有一定特征的细胞株。该细胞株的特点：1.它的染色体组型仍然是2n 的核型 2.具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性3.只有有限的增值能力，一般可连续传代培养50 代 4.无致瘤性转化细胞系是指通过某个转化过程形成的常由染色体的断裂变成了异构体，从而失去了正常细胞的特点而获得无限增殖能力的一类细胞真核细胞基因表达载体有两类：病毒载体、质粒载体病

3、毒载体-牛痘病毒（构建多价疫苗）、腺病毒、反转录病毒（用于基因治疗）、杆状病毒（用于基因的高效表达）杆状病毒作载体的优点：1.该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组2.插入 78kb 的 DNA 不影响正常病毒粒子的形成3.多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因仍能形成有感染力的病毒粒子4.多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生蛋白质可占全部蛋白质的20305.用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆6.如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。基因载体导入动物细胞的方法：融合法、化学法（DNA-磷酸钙沉淀法）、物理法（电穿孔法）、病毒法。磷

4、酸钙沉淀是将溶解的DNA 加在 Na2HPO4 溶液中，在逐渐加入CaCl2 溶液，当Na2HPO4 和 CaCl2 形成磷酸钙沉淀时，DNA 被包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸钙沉淀物，当该沉淀物与细胞接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA 导入其中。电穿孔法是借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源DNA 即可沿着该小孔进入细胞。细胞在体外培养的基本条件：1、所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染2、必须有足够的营养供应，绝不可有有害物质，避免即使是微量的有害离子的掺入3、保证有适量的氧气供应4、需要随时清除细胞代谢中产生的有害产

5、物5、有良好的适于生存的外界环境，包括PH、渗透压和离子浓度6、及时分种，保持适量的细胞密度。动物细胞的培养条件：1、器材的清洗和消毒灭菌2、水质（处理水质的方法：蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤、所有水质还需去除热原）3、PH 最适为7.27.4 为了保持培养基PH 的稳定，必须在培养基内加入各种缓冲系统（Na2HPO4/NaH2PO4、NaHCO3/CO2）4、渗透压平衡盐溶液（由无机盐和葡萄糖组成）5、温度 370.5 6、空气动物细胞培养基的种类：天然培养基、合成培养基、无血清培养基、无蛋白培养基（PFM）、限定化学成分培养基（CDM）动物细胞大规模培养的方法：悬浮培养、贴

6、壁培养和贴壁悬浮培养（微载体培养、包埋和微囊培养、结团培养）动物细胞培养的操作方式：分批式操作、补料分批式操作、半连续式操作、连续式操作、灌流式操作。基因工程制药基因工程技术就是将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞、构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。基因工程是通过Nucleic acid 分子的 Insert Assemble and Recombinant 而实现 germ plasm 的重新组合，再借助vims、Bacterium or other vectors,将 Target gene 转移到新的Host

7、Cell System 并使 Target gene在新的 Host Cell System 进行 Replication and Expression 的技术基因工程制药的基本过程：或的目的基因组建重组质粒构建基因工程菌（或细胞）培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装目的基因的获得方法：逆转录法、化学合成法、反转录聚合酶链反应法PCR 聚合酶链反应：1、变性（9495）2 退火低温 3755 3 延伸 适温 72宿主细胞的选择要求：1 具有高浓度、高产量、高产率2 能利用易得廉价原料3 不致病，不产生内毒素4 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态5 容易进行重组DNA 技

8、术6 产物容易提取纯化7 容易进行基因的代谢与调控基因表达的微生物宿主细胞原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌真核细胞：酵母菌丝状真菌哺乳动物细胞基因工程载体的特点：1 具有高效的运载能力2 本身是复制子3 装卸简单4 具有选择性遗传标志5 能控制外源基因的表达6 应用广泛 7 生物安全性好基因工程载体的分类：质粒、噬菌体、粘性质粒、M13 噬菌体、真核细胞病毒载体质粒染色体以外存在的共价、闭合、环状的双链DNA、cccDNA 质粒根据复制类型可分为严谨型（1十几个）和松弛型（几十个 几百个）；根据基因转移可分为传递性质粒（F 因子）和非传递性质粒（col因子、R 质粒）重组 DNA 向宿

9、主细胞转移的方法：转化（化学转化法CaCl2+NaHPO4）（电转化法）、转导、转染、显微注射等转化受体细胞从周围介质中吸收来自供体细胞的DNA 片段（常称为转化因子），并把它整合到自己的基因组中，从而获得新的遗传性状的现象。转导以病毒、噬菌体为媒介将目的基导入到宿主细胞转染把噬菌体或其它病毒的DNA（RNA）抽提出来，让它去感染受体的细胞，进而产生正常的噬菌体或病毒后代的现象。表达系统包括载体、启动子等控制序列和宿主细胞三个主要部分三类主要基因工程表达体系的比较基因工程菌的不稳定性主要体现在质粒的不稳定性。质粒的不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含

10、质粒的子代菌的现象。质粒的结构不稳定是DNA 从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。提高质粒稳定性的方法：1 选择合适的宿主菌2 选择合适的载体3 选择压力4 分阶段控制培养5 控制培养条件6 固定化基因工程药物的分离纯化步骤：细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品，成品加工。分离纯化主要依赖色谱分离法：色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱等。基因工程药物生产过程中常用的分离纯化方法：离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤层析。非蛋白质类杂质的去除DNA 的去处、热原质的去处、病毒的去除。酶工程制药酶从生物活细胞中

11、提取的一类具有生物催化作用的蛋白质或核酸。酶的特性：1 催化效率高2 高度的专一性3 反应条件比较温和4 催化的化学反应易调控酶工程是酶学和工程学相互渗透发展而形成的一门新的技术科学。现代酶工程研究的内容：1)酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发；2)酶和细胞的固定化及酶反应器的研究；3)酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；4)酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究；5)有机相中酶反应的研究；6)酶的抑制剂、激活剂的开发及其应用研究；7)抗体酶、核酸酶的研究；8)模拟酶、合成酶、酶分子的人工设计、合成的研究。酶的来源动物、植物和微生物。利用微生物生产酶制剂

12、的优点：1 微生物种类繁多，酶的品种齐全，可以数一切动植物体内存在的酶几乎都能从微生物中得到。2 生产周期短，产量高。3 微生物具有较强的适应能力和应变能力，可以通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产菌株。4 培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，并可通过控制培养条件来提高酶的产量。优良的产酶菌种应具备的要求：1 繁殖快，产酶量高，酶的性质符合使用要求，而且最好是产生胞外酶的菌。2 不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生有毒物质。3 产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体。4 能用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。改良生产菌的原理是遗传学原理，其基本途径有：基因突变，基

13、因转移和基因克隆。应用最广泛的产酶菌有：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。提高药用酶产量的措施：1 添加诱导物2 控制阻遏物浓度3 添加表面活性剂4 添加产酶促进剂5 添加刺激剂。固定化酶：经物理化学方法处理，把酶限制或固定于特定空间位置，使其不易流失或运动，而又能发挥催化作用的酶制剂。制定固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化细胞（第二代固定化酶）：被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。固定化原生质体：（第三代固定化酶）：1 制备原生质体2 固定化原生质体。酶和细胞的固定化方法：1 载体结合法（物理吸

14、附法、离子结合法、共价结合法）2 交联法3 包埋法（网格型、微囊型）4 热处理（选择性热变性）细胞。物理吸附法使用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的一种固定化方法。疏水结合力、氢键离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上的固定化方法。共价结合法是酶以共价键结合与载体上的固定化方法，也就是使酶分子上非活性部位功能团载体表面活泼基团之间发生化学反应而形成共价键的连接方法。其优点是使酶与载体结合牢固，稳定性好，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。载体活化的方法：基化、芳基化、烷基化及氨家鲜花反应等。是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。

15、将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的成为网格型；将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。选择性热变性法是将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定化于细胞内的方法。酶和细胞的固定化载体：吸附载体、包埋载体、交联载体。选择固定化方法应考虑的因素：1 固定化酶应用的安全性2 固定化酶在操作中的稳定性3 固定化的成本由于应用目的和反应器类型的不同，所以需要不同物理性状的固定化酶。固定化酶的性质：1 酶活力的变化2 酶稳定性的变化：a 操作稳定性b 贮藏稳定性c热稳定性 d 对蛋白酶的稳定性3 酶学特性的变化：a底物专一性 b 最适 PH c最适温度米氏常数Kmd 最大反应速度

16、eVmax(一般不变化)活力测定方法：1 分批测定法2 连续测定法。固定化方法及其特性比较：特征吸附法包埋法交联法共价法离子吸附法物理吸附法制备易易难易难结合力中弱强强强酶活性高中高低高载体再生能能不能不能极少用底物专一性不变不变不变变变稳定性中低高高高固定化成本低低中中高CDNA 的作用治疗真核生物抗肿瘤作用的酶是谷氨酰胺酶已知序列信息时获取目的基因最简单的方法是：PCR 聚合酶链反应法终止密码子有三个WAA、WAG、WGA;起始密码子有一个AWG 阻碍蛋白主要结合的是操纵子操纵子调节基因表达属于转录水平的调节传统药物包括：动物药物、植物药物、矿物药物。药物的发展简史：本草学-实验药物学-分

17、子药物学。抗体工程：1 多克隆抗体2 单克隆抗体3 基因工程抗体我国现有疾病2035 类共 18000 种。生物技术药物：采用DNA 重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。基因治疗：指遗传物质导入载体或受体细胞通过替代缺陷基因，修正错误基因，对抗异常基因，调节基因产物及表达方式，以实现治疗目的的一种方法。生物技术的发展简史：1 传统生物技术2 近代生物技术3 现代生物技术。基因表达：指结构基因在生物体中的转录、翻译及所有加工过程。真核基因在大肠杆菌中的表达形式：1 以融合蛋白的形式表达药物2 以非融合蛋白的形式表达药物3 分泌表达基因药物。基因工程与传统发酵工艺的区别：1 材料不同

18、基因工程菌需要带有外源基因的重组载体的微生物细胞发酵，所需不含外源基因的微生物本身。2 目的不同基因工程-获得大量的外源基因产物；尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。发酵-获得初级或次级代谢产物。非蛋白质类杂质的去除：1DNA 的去除2 热源质的去除3 病毒的去除。合成培养基中加入小牛血清的目的：1 提供有利于细胞生长所需的各种生长因子和激素2 提供有利于细胞贴壁所需的帖附因子和伸展因子3 提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白4 提供细胞生长所需的脂肪酸和微量元素。无血清培养的优点：1 提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响2 减少了有血清带来病毒、真菌和支原体等微生

19、物污染的危险3 供应充足、稳定4 细胞产品易于纯化5 避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性6 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于对实验结果的分析。转基因动物：将目的基因导入哺乳动物的受精卵或胚胎中，使目的基因与受精卵或胚胎中的染色体整合，随细胞分裂，目的基因随之倍增，染色体随之倍增，使每个细胞中都含有目的基因，并能稳定地遗传给下一代。植物来源的生物药物：1 脂肪和脂肪酸类2 固醇类3 磷脂类。生物制药技术主要研究内容：发酵工程制药技术、基因工程制药技术、细胞工程制药技术、酶工程制药技术、各种生物药物的原料来源及特性、生物药物特点及分类、生物药物的制备原理、生产工艺及设备、各种活性物质的

20、性质疗效药理及毒理。酶工程包含的内容1)酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发；2)酶和细胞的固定化及酶反应器的研究；3)酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；4)酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究；5)有机相中酶反应的研究；6)酶的抑制剂、激活剂的开发及其应用研究；7)抗体酶、核酸酶的研究；8)模拟酶、合成酶、酶分子的人工设计、合成的研究。单克隆抗体制备的一般流程抗原与动物的免疫：制备抗原选择亲本细胞免疫过程（体内免疫、体外免疫）细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养：PEG 诱导的融合选择筛选阳性克隆与克隆化杂交瘤细胞和抗体性状鉴定单克隆抗体的大量制备（体外

21、培养、动物体内培养）单克隆抗体的纯化（a.澄清和沉淀b.分离纯化）固定化酶、细胞的优点：酶：（1）可以在长时间内多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制（4）酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。细胞：(1)无需进行酶的分离纯化；(2)细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高；(3)细胞内酶比固定化酶稳定性高；(4)细胞内酶的辅因子可自动再生；(5)细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；(6)抗污染能力强。生物技

22、术制药：就是利用基因工程技术、细胞工程技术、微生物工程技术、酶工程技术、蛋白质工程技术、分子生物学技术等来研究和开发药物，用来诊断、治疗和预防疾病的发生。基因工程技术：基因工程技术又叫基因拼接技术或DNA 重组技术。将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌；实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。利用基因工程技术生产药物的优点？1 大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物

23、质；4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。基因工程药物制造的主要步骤？目的基因的克隆；构建DNA 重组体；将 DNA 重组体转移入宿主菌构建工程菌；工程菌的发酵；外源基因表达产物的分离纯化；产品的检验等。真核基因在大肠杆菌中的表达形式？有三种形式：(1)融合蛋白的表达形式。（由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质,称为融合蛋白.。）(2)非融合蛋白的表达形式。(3)分泌型表达形式生物药物的特性1）药理学特性（1）治疗的针对性强：细胞色素c 用于治疗组织缺氧所引起的一系列疾病。（2）药理活性高

24、：注射用的纯 ATP 可以直接供给机体能量。（3）毒副作用小、营养价值高：蛋白质、核酸、糖类、脂类等生物药物本身就直接取自体内。（4）生理副作用时有发生：生物体之间的种属差异或同种生物体之间的个体差异都很大，所以用药时会发生免疫反应和过敏反应。2）生产、制备中的特殊性（1）原料中的有效物质含量低：激素、酶在体内含量极低。（2）稳定性差：生物药物的分子结构中具有特定的活性部位，该部位有严格的空间结构，一旦结构破坏，生物活性也就随着消失。（3）易腐败：生物药物营养价值高，易染菌、腐败。生产过程中应低温、无菌。（4）注射用药有特殊要求：均一性、安全性、稳定性、有效性。理化性质、检验方法、剂型、剂量、

25、处方、储存方式。（5）储存特性 3）检验上的特殊性：由于生物药物具有生理功能，因此生物药物不仅要有理化检验指标，更要有生物活性检验指标。基因工程治药的优点1、利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入研究，从而扩大这些物质的使用范围3、利用基因工程技术可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质4、内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除5、利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源基因工程药物制造的主要程序a.目的基因克隆b.构建 DN

26、A 重组体 c.将 DNA 重组体转入宿主菌构建工程菌d.目的基因的表达e.外源基因表达产物的分离纯化f.产品检验反转录法获得目的基因的步骤mRNA 的纯化c DNA 第一链的合成c DNA 第二链的合成c DNA 的克隆：重组体转入宿主细胞；c DNA 文库的鉴定；目的c DNA 克隆的分离与鉴定生物制药技术Biological pharmaceutical technology 转基因动物Transgenic animals 基因工程 Genetic engineering发酵工程 Fermentation engineering细胞工程 Cell engineering酶工程 Enzym

27、e engineering蛋白质工程Protein engineering糖链工程 Sugar chains engineering表达载体 Expression vector半保留复制Half keep copy啤酒酵母 Beer yeast 转化、转导、转染Conversion,transduction,carrying 基因工程制药的步骤Genetic engineering pharmaceutical steps获得目的基因et purpose gene,组建重组质粒form a reorganization quality inspection,(form the quality

28、of the organization)培养工程菌Training project virus构建基因工程菌constructing gene engineering bacterium,产物分离纯化separation and purification products 除菌过滤、半成品检定、成品检定、包装Aseptic filtration,semi-finished products verification,finished product verification,packaging 组织培养 Tissue culture 干扰素 interferon 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)