第五章酶类--王镜岩《生物化学》第三版笔记(完美打印版).pdf

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1、祝大家 07 年生物考研取得好成绩学子272646652 38第五章酶 类提要一.概述酶的特性酶的分类二.酶的结构单纯酶结合酶辅酶与辅基单体酶寡聚酶多酶体系 活性中心同工酶三.酶的催化机制诱导契合假说酶加快反应速度的因素四.酶促发应动力学米氏方程米氏常数及意义bi-bi 反应影响酶促反应的因素激活剂抑制剂竞争性抑制非竞争性抑制五.酶的调节变构调节共价修饰调节酶原酶原激活第一节概述一、定义酶是一种生物催化剂，是有催化功能的蛋白质。二、人们对酶的认识过程1833 年佩延（Payen）和 Persoz 从麦芽中抽提出一种对热敏感的物质，这种物质能将淀粉水解成可溶性糖，被称为淀粉糖化酶（diastas

2、e），意思是“分离”。所以后人命名酶时常加词尾-ase。由于他们用乙醇沉淀等方法提纯得到了无细胞的酶制剂，并发现了酶的催化特性和热不稳定性，所以一般认为他们首先发现了酶。19 世纪西方对发酵现象的研究推动了对酶的进一步研究。巴斯德提出“酵素”一词，认为只有活的酵母细胞才能进行发酵。现在日本还经常使用“酵素”一词（ferment）。1878 年德国人库恩（Kuhne）提出“Enzyme”一词，意为“在酵母中”。1896 年德国人巴克纳（Buchner）兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，得到了能催化发酵的无细胞滤液，证明发酵是一种化学反应，与细胞的活力无关。这项发现涉及到了酶的本质，有人认为这是酶学研究的

3、开始。1913 年米凯利斯（Michaelis）和门顿（Menten）利用物理化学方法提出了酶促反应的动力学原理米氏学说，使酶学可以定量研究。1926年美国人 J.B.Sumner从刀豆中结晶出脲酶（第一个酶结晶），并提出酶是蛋白质的观点。后来陆续得到多种酶的结晶，证明了这种观点，萨姆纳因而获得1947年诺贝尔奖。此后多种酶被发现、结晶、测定结构，并产生了酶工程等分支学科。祝大家 07 年生物考研取得好成绩学子272646652 39进入 80 年代后，核糖酶（ribozyme）、抗体酶、模拟酶等相继出现，酶的传统概念受到挑战。1982年 Cech 等发现四膜虫26S rRNA前体具有自我剪接

4、功能，并于 1986 年证明其内含子L-19 IVS 具有多种催化功能。此后陆续发现多种具有催化功能的RNA，底物也扩大到DNA、糖类、氨基酸酯。还有人在实验室中设计合成新的核糖酶。甚至有人发现博莱霉素等肽类抗生素也有催化能力。这些新发现不仅增加了对酶的本质的研究，也有助于对生命起源等问题的探讨，使酶学研究进入新的阶段。三、酶的特性酶是生物体产生的，有催化能力的蛋白质。细胞内的蛋白质，90都有催化活性。酶是一种生物催化剂，与一般催化剂一样，只改变反应速度，不改变化学平衡，并在反应前后本身不变。但酶作为生物催化剂，与一般的无机催化剂相比有以下特点：1.催化效率高酶的催化效率比无机催化剂高1061

5、013 倍。举例来说，1mol 马肝过氧化氢酶在一定条件下可催化5 106 摩尔过氧化氢分解，在同样条件下 1mol 铁只能催化6 104 摩尔过氧化氢分解。因此，这个酶的催化效率是铁的1010 倍。也就是说，用过氧化氢酶在1 秒内催化的反应，同样数量的铁需要300 年才能反应完。2.专一性强一般催化剂对底物没有严格的要求，能催化多种反应，而酶只催化某一类物质的一种反应，生成特定的产物。因此酶的种类也是多种多样的。酶催化的反应称为酶促反应，酶促反应的反应物称为底物。酶只催化某一类底物发生特定的反应，产生一定的产物，这种特性称为酶的专一性。各种酶的专一性不同，包括结构专一性和立体专一性两大类，结

6、构专一性又有绝对专一性和相对专一性之分。绝对专一性指酶只催化一种底物，生成确定的产物。如氨基酸：tRNA连接酶，只催化一种氨基酸与其受体tRNA 的连接反应。相对专一性指酶催化一类底物或化学键的反应。如醇脱氢酶可催化许多醇类的氧化反应。还有许多酶具有立体专一性，对底物的构型有严格的要求。如乳酸脱氢酶只能催化L-乳酸，不能催化D-乳酸的反应。3.反应条件温和酶促反应不需要高温高压及强酸强碱等剧烈条件，在常温常压下即可完成。4.酶的活性受多种因素调节无机催化剂的催化能力一般是不变的，而酶的活性则受到很多因素的影响。比如底物和产物的浓度、pH 值以及各种激素的浓度都对酶活有较大影响。酶活的变化使酶能

7、适祝大家 07 年生物考研取得好成绩学子272646652 40应生物体内复杂多变的环境条件和多种多样的生理需要。生物通过变构、酶原活化、可逆磷酸化等方式对机体的代谢进行调节。5.稳定性差酶是蛋白质，只能在常温、常压、近中性的条件下发挥作用。高温、高压、强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、超声波、剧烈搅拌、甚至泡沫的表面张力等都有可能使酶变性失活。不过自然界中的酶是多种多样的，有些酶可以在极端条件下起作用。有些细菌生活在极端条件下，如超噬热菌可以生活在 90 以上环境中，高限为 110；噬冷菌最适温度为 2，高于 10不能生长；噬酸菌生活在 pH1 以下，噬碱菌的最适pH 大于 11；噬压菌最高可

8、耐受1035 个大气压。这些噬极菌的胞内酶较为正常，但胞外酶却可以耐受极端条件的作用。有些酶在有机溶剂中可以催化在水相中无法完成的反应。四、酶的命名与分类1.命名酶的命名法有两种：习惯命名与系统命名。习惯命名以酶的底物和反应类型命名，有时还加上酶的来源。习惯命名简单，常用，但缺乏系统性，不准确。1961年国际酶学会议提出了酶的系统命名法。规定应标明酶的底物及反应类型，两个底物间用冒号隔开，水可省略。如乙醇脱氢酶的系统命名是：醇：NAD+氧化还原酶。2.分类按照催化反应的类型，国际酶学委员会将酶分为六大类。在这六大类里，又各自分为若干亚类，亚类下又分小组。亚类的划分标准：氧化还原酶是电子供体类型

9、，移换酶是被转移基团的形状，水解酶是被水解的键的类型，裂合酶是被裂解的键的类型，异构酶是异构作用的类型，合成酶是生成的键的类型。（1）氧化还原酶催化氧化还原反应，如葡萄糖氧化酶，各种脱氢酶等。是已发现的量最大的一类酶，其氧化、产能、解毒功能，在生产中的应用仅次于水解酶。需要辅因子，可根据反应时辅因子的光电性质变化来测定。按系统命名可分为19 亚类，习惯上可分为4 个亚类：2脱氢酶：受体为NAD 或 NADP，不需氧。2氧化酶：以分子氧为受体，产物可为水或H2O2，常需黄素辅基。2过氧物酶：以H2O2 为受体，常以黄素、血红素为辅基祝大家 07 年生物考研取得好成绩学子272646652 412

10、氧合酶（加氧酶）：催化氧原子掺入有机分子，又称羟化酶。按掺入氧原子个数可分为单加氧酶和双加氧酶。（2）移换酶类催化功能基团的转移反应，如各种转氨酶和激酶分别催化转移氨基和磷酸基的反应。移换酶也叫转移酶，多需要辅酶，但反应不易测定。按转移基团性质，可分为8 个亚类，较重要的有：2一碳基转移酶：转移一碳单位，与核酸、蛋白质甲基化有关。2磷酸基转移酶：常称为激酶，多以ATP 为供体。少数蛋白酶也称为激酶（如肠激酶）。2糖苷转移酶：与多糖代谢密切相关，如糖原磷酸化酶。（3）水解酶类催化底物的水解反应，如蛋白酶、脂肪酶等。起降解作用，多位于胞外或溶酶体中。有些蛋白酶也称为激酶。可分为水解酯键（如限制性内

11、切酶）、糖苷键（如果胶酶、溶菌酶等）、肽键、碳氮键等 11 亚类。（4）裂合酶类催化从底物上移去一个小分子而留下双键的反应或其逆反应。包括醛缩酶、水化酶、脱羧酶等。共7 个亚类。（5）异构酶类催化同分异构体之间的相互转化。包括消旋酶、异构酶、变位酶等。共6 个亚类。（6）合成酶类催化由两种物质合成一种物质，必须与 ATP 分解相偶联。也叫连接酶，如DNA 连接酶。共 5 个亚类。3.酶的编号国际酶学委员会根据酶的类别，给每种酶规定了统一的编号。酶的编号由EC 和 4 个用圆点隔开的数字组成。EC 表示酶学委员会，第一个数字表示酶的类别，第二个数字表示酶的亚类，第三个数字表示酶的小组，第四个数字

12、表示酶在小组中的序列号。如 EC1.1.1.1 表示这个酶是氧化还原酶，电子供体是醇，电子受体是NAD+,序列号是 1，即乙醇脱氢酶。胰蛋白酶的编号是EC3.4.4.4，4 个数字分别表示它的类型是水解酶；水解的键是肽键；是内切酶而不是外切酶；序列号是4。多功能酶可以有多个编号。五、酶的活力1.定义 指酶催化一定化学反应的能力。2.单位 在特定条件下，1 分钟内转化 1 微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)。温度规定为25 度，其他条件取反应的最适条件。比活：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是 u/mg。祝大家 07 年生物考研取得好成绩学子272646652 42比活越高则酶越纯。转化数

13、：每分子酶或每个酶活性中心在单位时间内能催化的底物分子数(TN)。相当于酶反应的速度常数 kp。也称为催化常数（Kcat）。1/kp 称为催化周期。碳酸酐酶是已知转换数最高的酶之一，高达 36 106 每分，催化周期为1.7 微秒。3.测定一般采用测定酶促反应初速度的方法来测定活力，因为此时干扰因素较少，速度保持恒定。反应速度的单位是浓度/单位时间，可用底物减少或产物增加的量来表示。因为产物浓度从无到有，变化较大，而底物往往过量，其变化不易测准，所以多用产物来测定。第二节酶的结构一、酶分子的化学组成酶的本质是蛋白质。酶与其他蛋白一样，由氨基酸构成，具有一、二、三、四级结构。酶也会受到某些物理、

14、化学因素作用而发生变性，失去活力。酶分子量很大，具有胶体性质，不能透析。酶也能被蛋白酶水解。1.辅因子有些酶完全由蛋白质构成，属于简单蛋白，如脲酶、蛋白酶等；有些酶除蛋白质外，还含有非蛋白成分，属于结合蛋白。其中的非蛋白成分称为辅因子(cofactor)，蛋白部分成为酶蛋白，复合物叫全酶。辅因子一般起携带及转移电子或功能基团的作用，其中与酶蛋白以共价键紧密结合的称为辅基，以非共价键松散结合的称为辅酶。在催化过程中，辅基不与酶蛋白分离，只作为酶内载体起作用，如黄素蛋白类酶分子中的FAD、FMN辅基携带氢，羧化酶的生物素辅基携带羧基等等。辅酶则常作为酶间载体，将两个酶促反应连接起来，如 NAD+在

15、一个反应中被还原成NADH，在另一个反应中又被氧化回NAD+。它在反应中象底物一样，有时也称为辅底物。有 30以上的酶需要金属元素作为辅因子。有些酶的金属离子与酶蛋白结合紧密，不易分离，称为金属酶；有些酶的金属离子结合松散，称为金属活化酶。金属酶的辅因子一般是过渡金属，如铁、锌、铜、锰等；金属活化酶的辅因子一般是碱金属或碱土金属，如钾、钙、镁等。2.单体酶、寡聚酶和多酶体系由一条肽链构成的酶称为单体酶，由多条肽链以非共价键结合而成的酶称为寡聚酶，属于寡聚蛋白。有时在生物体内一些功能相关的酶被组织起来，构祝大家 07 年生物考研取得好成绩学子272646652 43成多酶体系，依次催化有关的反应

16、。构成多酶体系是代谢的需要，可以降低底物和产物的扩散限制，提高总反应的速度和效率。有时一条肽链上有多种酶活性，称为多酶融合体。如糖原分解中的脱支酶在一条肽链上有淀粉-1，6-葡萄糖苷酶和4-D-葡聚糖转移酶活性；来自樟树种子的克木毒蛋白（camphorin）由一条肽链组成，有三种活性：RNA N-糖苷酶活性，可水解大鼠28S rRNA 中第 4324 位腺苷酸的糖苷键，释放一个腺嘌呤；依赖于超螺旋DNA 构型的核酸内切酶活性，专一解旋并切割超螺旋环状DNA 形成缺口环状和线状DNA；超氧化物歧化酶活性。来自红色链孢霉的AROM 多酶融合体是二聚体，每条肽链含五种酶活性，可催化莽草酸途径的第二至

17、第六步反应，由于有中间产物的传递通道，使催化效率大为提高。二、酶的活性中心1.定义酶是大分子，其分子量一般在一万以上，由数百个氨基酸组成。而酶的底物一般很小，所以，直接与底物接触并起催化作用的只是酶分子中的一小部分。有些酶的底物虽然较大，但与酶接触的也只是一个很小的区域。因此，人们认为，酶分子中有一个活性中心，它是酶分子的一小部分，是酶分子中与底物结合并催化反应的场所。活性中心是有酶分子中少数几个氨基酸残基构成的，它们在一级结构上可能相距很远，甚至位于不同的肽链上，由于肽链的盘曲折叠而互相接近，构成一个特定的活性结构。因此活性中心不是一个点或面，而是一个小的空间区域。2.分类活性中心的氨基酸按

18、功能可分为底物结合部位和催化部位。前者负责识别特定的底物并与之结合。它们决定了酶的底物专一性。催化部位是起催化作用的，底物的敏感键在此被切断或形成新键，并生成产物。二者的分别并不是绝对的，有些基团既有底物结合功能又有催化功能。Koshland将酶分子中的残基分为四类：接触亚基负责底物的结合与催化，辅助亚基起协助作用，结构亚基维持酶的构象，非贡献亚基的替换对活性无影响，但对酶的免疫、运输、调控与寿命等有作用。前二者构成活性中心，前三者称为酶的必须基团。活性中心以外的部分并不是无用的，它们能够维持酶的空间结构，使活性中心保持完整。在酶与底物祝大家 07 年生物考研取得好成绩学子272646652

19、44结合后，整个酶分子的构象发生变化，这种扭动的张力使底物化学键容易断裂。这种变化也要依靠非活性中心的协同作用。一般单体酶只有一个活性中心，但有些具有多种功能的多功能酶具有多个活性中心。如大肠杆菌DNA聚合酶 I 是一条 109kd 的肽链，既有聚合酶活性，又有外切酶活性。3.形成过程有些酶在细胞内刚刚合成或分泌时，尚不具有催化活性，这些无活性的酶的前体称为酶原。酶原通过激活才能转化为有活性的酶。酶原的激活是通过改变酶分子的共价结构来控制酶活性的一种机制，通过肽链的剪切，改变蛋白的构象，从而形成或暴露酶的活性中心，使酶原在必要时被活化成为有活性的酶，发挥其功能。4.研究活性中心的方法酶的底物和

20、竞争性抑制剂的结构特点有助于研究酶的活性中心的结构。酶的最适pH 及速度常数等动力学特点也可提供一些信息。化学修饰在活性中心的研究中起过很重要的作用。因为活性中心的基团反应性常与其他基团不同，所以一些试剂可以专一性地与活性中心中的某种残基反应，而不与活性中心外的残基作用。如DFP（二异丙基氟磷酸）可与活性中心中的丝氨酸反应。TPCK（N-对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮）的专一性更强，只能与糜蛋白酶活性中心的His-57结合，称为亲和标记。它是底物类似物，烷化剂。TLCK（赖氨酸衍生物）作用于胰酶的His-46。某些试剂的专一性不强，可用差示标记法：先用底物类似物保护活性中心，加入修饰剂，与活性中心

21、以外的基团反应，然后除去抑制剂，再加入放射性标记的试剂，此时试剂只能与活性中心的基团反应，测定放射性的位置，即可找到活性中心。紫外、荧光、园二色光谱等方法也可用与活性中心的研究。在酶与底物结合时，位于底物结合部位的生色团必然会发生某种变化，从而导致其光谱的变化。这些生色团可以是酶本身带有的，也可以人工引入。这种方法可以用来判断活性中心的构成，也可以研究催化的反应过程。最直接最准确的方法是X-射线衍射。三、同工酶同工酶是同一生物催化同一反应的不同的酶分子。同工酶的催化作用相同，但其功能意义有所不同。不同种生物有相同功能的酶不是同工酶。同工酶具祝大家 07 年生物考研取得好成绩学子27264665

22、2 45有相同或相似的活性中心，但其理化性质和免疫学性质不同。同工酶的细胞定位、专一性、活性及其调节可有所不同。每种同工酶都有其独特的功能意义。如乳酸脱氢酶(LDH)是由 4 个亚基组成的四聚体。亚基有A(M)和 B(H)两种，有5 种同工酶：LDH1(H4)、LDH2(MH3)、LDH3(M2H2)、LDH4(M3H)、LDH5(M4)。M、H 两个亚基由不同基因编码，在不同细胞中合成速度不同，所以在不同的组织器官中5 种同工酶的比例不同，经电泳分离后会得到不同的同工酶谱。人体心肌中LDH1 和LDH2 较多，而骨骼肌中LDH5 较多。M 亚基对丙酮酸的 Km 较高，且不受底物抑制，因而肌肉

23、可生成大量乳酸；H 亚基的 Km 小，并受底物抑制，随底物增加很快饱和，所以心脏生成乳酸很少，此酶主要用于乳酸的氧化。临床上通过分析病人血清LDH 同工酶谱，有助于诊断病变发生的部位。如心肌损害时血清中LDH1 升高；肺损害时 LDH3 升高。第三节酶的催化机制一、酶与底物的结合酶与底物结合的作用力主要是氢键、盐键和范德华力。盐键是带电荷基团之间的静电吸引力，疏水基团之间的作用也称为疏水键。酶与底物的结合是有专一性的，人们曾经用锁和钥匙来比喻酶和底物的关系。这种“锁钥学说”是不全面的。比如，酶既能与底物结合，也能与产物结合，催化其逆反应。于是又提出了“诱导契合学说”,认为当酶与底物接近时，酶蛋

24、白受底物分子的诱导，其构象发生改变，变得有利于与底物的结合和催化。二、酶加快反应速度的因素酶加快反应速度主要靠降低反应的活化能，即底物分子达到活化态所需的能量。例如脲酶可使尿素水解反应的活化能由136kj/mol降到 46kj/mol，使反应速度提高1014 倍。酶的催化机理主要有以下几点：1.邻近定向对一个双分子反应，酶可以使两个底物结合在活性中心彼此靠近，并具有一定的取向。这比在溶液中随机碰撞更容易反应。对不同的反应，由分子间反应变成分子内反应后，反应速度可加快100 倍到 1011 倍。2.底物形变酶与底物结合时，不仅酶的构象改变，底物的构象也会发生变化。这种变化使底物更接近于过渡态，因

25、此可以降低活化能。3.酸碱催化和共价催化酶活性中心的一些残基的侧链基团可以起酸碱催化或共价催化的作用。酸碱祝大家 07 年生物考研取得好成绩学子272646652 46催化可分为一般酸碱催化和特殊酸碱催化两种，特殊酸碱催化是指H+和 OH-的催化作用；一般酸碱催化还包括其他弱酸弱碱的催化作用。酶促反应一般发生在近中性条件，H+和 OH-的浓度很低，所以酶促反应主要是一般酸碱催化。酶分子中的一些可解离集团如咪唑基、羧基、氨基、巯基常起一般酸碱催化作用，其中咪唑最活泼有效。有些酶有酸碱共催化机制及质子转移通路。四甲基葡萄糖在苯中的变旋反应如果单独用吡啶（碱）或酚（酸）来催化，速度很慢；如果二者混合

26、催化，则速度加快，即酸碱共催化。如果把酸和碱集中在一个分子中，即合成羟基吡啶，它的催化速度又加快 7000 倍。这是因为两个催化集团集中在一个分子中有利于质子的传递。在酶底物复合物中经常由氢键和共轭结构形成质子传递通路，从而大大提高催化效率。共价催化可分为亲电催化和亲核催化。丝氨酸蛋白酶、含巯基的木瓜蛋白酶、以硫胺素为辅酶的丙酮酸脱羧酶都有亲核催化作用。羟基、巯基和咪唑基都有亲核催化作用。金属离子和酪氨酸羟基、NH3+都是亲电基团。共价催化经常形成反应活性很高的共价中间物，将一步反应变成两步或多步反应，绕过较高的能垒，使反应快速进行。例如胰蛋白酶通过丝氨酸侧链羟基形成酰基-酶共价中间物，降低活

27、化能。4.微环境的作用有些酶的活性中心是一个疏水的微环境，其介电常数较低，有利于电荷之间的作用，也有利于中间物的生成和稳定。如赖氨酸侧链氨基的 pK 约为 9，而在乙酰乙酸脱羧酶活性中心的赖氨酸侧链 pK 只有 6 左右。以上几点都可加速反应，但每种酶不同，可同时具有其中的几种因素。第四节酶促反应的动力学酶促反应的动力学是研究酶促反应的速度以及影响速度的各种因素的科学。动力学研究既可以为酶的机理研究提供实验证据，又可以指导酶在生产中的应用，最大限度地发挥酶的催化作用。一、米氏方程1.米氏方程的推导米氏学说是1913 年 Michaelis 和 Menton 建立的，认为反应分为两步，先生成酶-

28、底物复合物（中间产物），再分解形成产物，释放出游离酶。经过 Briggs和 Haldane的补充与发展，得到了现在的米氏方程。祝大家 07 年生物考研取得好成绩学子272646652 47对于上面的反应，首先有三点假设：第一，底物大过量，即 S E。第二，在反应初期，产物浓度极小，忽略逆反应即k-2=0；第三，稳态假设，即随着反应的进行，复合物的形成速度逐渐降低，分解加快，在某一时刻达到平衡，复合物的浓度为常数，这种状态称为“稳态”。体系达到稳态后，底物的消耗和产物的生成速度都是常数，且相等。经测定，酶加入体系后，在几毫秒之内即可达到稳态，所以我们测定的初速度通常是稳态速度。在产物积累较多之前

29、，体系一直保持稳态，所以反应速度v=k2ES。根据稳态假设，有k1ES=(k-1+k2)ES，即ES=k1ES/(k-1+k2)。定义(k-1+k2)/k1=Km，因为 E=E0-ES，故ES=E0S/(Km+S)。代 入 速 度 方 程，得 到v=k2E0S/(Km+S)。因为当 ES=E0 时速度最大，所以 Vm=k2E0。代入，得到下列米氏方程：v=Vm S/(Km+S)2.米氏常数的意义米氏常数的物理意义是反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。其酶学意义在于，它是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。不同的酶其 Km 不同，同种酶对不同底物也不同。在k2 极小时1/Km可近

30、似表示酶与底物的亲和力，1/Km 越大，亲和力越大。在酶的多种底物中，Km最小的底物叫做该酶的天然底物。3.米氏常数的测定从酶的 v-s 图上可以得到Vm，再从 1/2Vm 处读出s，即为Km。但实际上只能无限接近Vm，却无法达到。为得到准确的米氏常数，可以把米氏方程加以变形，使它相当于线性方程，通过作图得到准确的米氏常数。双倒数作图法将方程改写为1/v=Km/Vm 1/S+1/Vm 实验时在不同的底物浓度测定初速度，以1/v 对1/S 作图，直线外推与横轴相交，横轴截踞为-1/Km，纵 轴 截 踞 为1/Vm。此 法 称 为Lineweaver-Burk作图法，应用最广，但实验点常集中在左端，作图不易准确。Eadie-Hofstee法 将方程改写为v=-Km v/S+Vm 以 v 对 v/S 作图，直线斜率为-Km。4.其他动力学参数Kcat/Km 称为酶的专一性常数，它不受非生产性结