医学专题—第三章：(酶工程)-动植物细胞培养产酶5067.ppt

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1、植物细胞(xbo)结构第一页，共二十五页。植物、动物、微生物细胞的特性植物、动物、微生物细胞的特性(txng)(txng)比较比较细胞种类细胞种类植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞细胞大小细胞大小/um20030011010100倍增时间倍增时间/h120.3-615营养要求营养要求简单简单简单简单复杂复杂光照要求光照要求大多数要求大多数要求不要求不要求不要求不要求对剪切力对剪切力敏感敏感大多数不敏感大多数不敏感非常敏感非常敏感主要产物主要产物色色素素、药药物物、香精、酶等香精、酶等醇、有机酸、氨醇、有机酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫疫苗苗、激激

2、素素、单单克克隆隆抗抗体体、酶等酶等第二页，共二十五页。三者之间的差异主要有：三者之间的差异主要有：植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 微生物细胞。微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单(jindn)(jindn)。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。第

3、三页，共二十五页。一、植物细胞培养产酶一、植物细胞培养产酶从外植体中从外植体中选育植物细胞选育植物细胞高产稳定高产稳定(wndng)(wndng)细胞细胞培养培养各种产物各种产物 1.1.植物细胞培养的特点植物细胞培养的特点 提高产率和产品质量提高产率和产品质量 缩短周期缩短周期 易于管理易于管理 第四页，共二十五页。2.2.培养基特点培养基特点 需要大量无机盐需要大量无机盐 需多种维生素和激素需多种维生素和激素 氮源一般为无机氮氮源一般为无机氮 一般以蔗糖为碳源一般以蔗糖为碳源n应用最广的是应用最广的是MSMS培养基和培养基和LSLS培养基培养基 MSMS培养基是培养基是19621962年为

4、烟草细胞培养而设计年为烟草细胞培养而设计(shj)(shj)的培养基。的培养基。LSLS培养基是在其基础上演变而来的。培养基是在其基础上演变而来的。P82P82表表3-33-3第五页，共二十五页。3.3.培养工艺：培养工艺：悬浮细胞培养悬浮细胞培养工艺流程工艺流程外植体外植体细胞的获取细胞的获取细胞培养细胞培养分离分离纯化产纯化产物物外植体选择和处理外植体选择和处理选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把茎、选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把茎、叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。用叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。用70%-70%-75%75%乙醇，乙醇，0.1%0.

5、1%升汞消毒升汞消毒(xio d)(xio d)，无菌水漂洗。，无菌水漂洗。第六页，共二十五页。外植体：外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。小块。愈伤组织：愈伤组织：将上述外植体植入诱导培养基中，于将上述外植体植入诱导培养基中，于2525左右培养左右培养一段时间，从外植体的切口一段时间，从外植体的切口(qi ku)(qi ku)部位长出小细胞团。部位长出小细胞团。第七页，共二十五页。水稻水稻(shudo)的外植体的外植

6、体（幼胚）和愈伤组（幼胚）和愈伤组织织外植体外植体愈伤组织愈伤组织(zzh)(zzh)第八页，共二十五页。植物细胞获取植物细胞获取 直接分离法直接分离法 愈伤组织诱导法愈伤组织诱导法 原生质体再生原生质体再生(zishng)(zishng)法法细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反应器中进行培养应器中进行培养分离纯化：生化技术分离纯化：生化技术机械机械(jxi)法法酶法酶法第九页，共二十五页。培养条件的影响与控制培养条件的影响与控制温度：室温温度：室温2525pHpH：微酸性范围：微酸性范围(fnwi)(fnwi)。即。即pH 5.0-6.05.0-6.0通气与搅

7、拌通气与搅拌光照的控制：强度和时间有一定要求光照的控制：强度和时间有一定要求前体的添加（饲喂）前体的添加（饲喂）刺激剂的应用刺激剂的应用第十页，共二十五页。4.4.植物细胞培养产酶实例植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SODSOD）为例）为例(1)(1)大蒜愈伤组织的诱导大蒜愈伤组织的诱导 选取结实选取结实(ji shi)(ji shi)、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用外皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升汞消毒升汞消毒10min10min，然，然后无菌水

8、漂洗后无菌水漂洗3 3次。次。在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成0.5cm0.5cm3 3的小块，植入含有的小块，植入含有3mg/L 3mg/L 2,4-D2,4-D和和1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA 的半固体的半固体MSMS培养基中，在培养基中，在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下培养光照条件下培养18d18d，诱导得到愈伤组织，诱导得到愈伤组织，每每1818天继代一次。天继代一次。第十一页，共二十五页。(2)(2)大蒜悬浮细胞培养大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体将上述在半固体MSMS培养培养(piyng)(piyng)基上培养基上培养(

9、piyng)(piyng)18d18d的愈的愈伤组织，在无菌条件下转入含有伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和 1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA（苄基腺嘌呤）（苄基腺嘌呤）的液体的液体MSMS培养基中，加培养基中，加入灭菌的玻璃珠，入灭菌的玻璃珠，2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡光照条件下震荡培养培养18d18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有胞转入含有3mg/L

10、 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA 的液体的液体MSMS培培养基中，养基中，25,600lux25,600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡培养光照条件下震荡培养18d18d。第十二页，共二十五页。(3)(3)酶的分离纯化酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取碎、提取(tq)(tq)、分离得到超氧化物歧化酶。、分离得到超氧化物歧化酶。第十三页，共二十五页。二、动物细胞培养产酶二、动物细胞培养产酶 1.1.动物细胞培养的特点动物细胞培养的特点动物细胞可以产生各种有效高价值的物质动

11、物细胞可以产生各种有效高价值的物质需添加抗生素（常用需添加抗生素（常用(chn yn)(chn yn)青霉素和链霉素联合）青霉素和链霉素联合）细胞生长速度慢细胞生长速度慢细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。反应过程成本高，产品价格贵反应过程成本高，产品价格贵细胞具有锚地依赖性。宜采用贴壁培养细胞具有锚地依赖性。宜采用贴壁培养原代细胞一般繁殖原代细胞一般繁殖5050代代第十四页，共二十五页。2.2.培养方式培养方式(1)(1)悬浮悬浮(xunf)(xunf)培养培养(2)(2)贴壁培养贴壁培养 滚瓶培养滚瓶培养 微载体培养微载体培养(microcarr

12、ier culture)(microcarrier culture)(3)(3)固定化细胞培养固定化细胞培养包埋包埋(entrapment)(entrapment)和和中空纤维中空纤维(microencapsulation)(microencapsulation)培养培养第十五页，共二十五页。3.工艺控制工艺控制 工艺流程工艺流程 种质细胞种质细胞(xbo)（体细胞；杂交瘤细胞）（体细胞；杂交瘤细胞）分散成悬浮细胞分散成悬浮细胞 细胞悬浮或贴壁培养细胞悬浮或贴壁培养 收集收集 分离纯化分离纯化 产物产物 胰蛋白酶胰蛋白酶(y dn bi mi)消化消化第十六页，共二十五页。培养条件的影响与控制

13、培养条件的影响与控制温度：一般控制在温度：一般控制在36.5.36.5.pHpH值：一般控制在值：一般控制在7.0-7.67.0-7.6的微碱性范围内。的微碱性范围内。渗透压渗透压:应与细胞内渗透压相同应与细胞内渗透压相同(xin tn)(xin tn)。溶解氧：根据情况随时调节。溶解氧：根据情况随时调节。第十七页，共二十五页。4.产酶实例产酶实例(shl)以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂为例激活剂为例纤溶酶原纤溶酶原 纤溶酶纤溶酶纤溶酶原纤溶酶原(mi yun)激活剂激活剂第十八页，共二十五页。种质细胞用胰蛋白酶处理，分散，种质细胞用胰蛋白酶处理

14、，分散，pH7.4pH7.4磷酸盐洗涤。磷酸盐洗涤。稀释成细胞悬浮液稀释成细胞悬浮液接种到反应器中，与接种到反应器中，与37 CO37 CO2 2培养箱中，长成致培养箱中，长成致密单层密单层去培养液，用去培养液，用pH7.4pH7.4磷酸盐冲洗细胞磷酸盐冲洗细胞换无血清换无血清EagleEagle培养液，继续培养液，继续(jx)(jx)培养培养每每3-43-4天，取出培养液分离纯化天，取出培养液分离纯化再加新鲜再加新鲜EagleEagle培养液，继续培养培养液，继续培养亲和层析进行分离亲和层析进行分离第十九页，共二十五页。细胞细胞(xbo)生产滚瓶培养生产滚瓶培养装置装置第二十页，共二十五页。

15、第二十一页，共二十五页。第一章第一章作业作业(zuy)：1.1.概念概念 酶活力酶活力(hul)(hul)单位单位 酶比活力酶比活力2.2.酶工程的主要任务和主要内容是什么？酶工程的主要任务和主要内容是什么？3.3.写出酶活力测定的一般步骤。写出酶活力测定的一般步骤。第二十二页，共二十五页。第二章第二章作业作业(zuy)：1.1.概念：产物阻遏；分解代谢物阻遏；酶合成的诱概念：产物阻遏；分解代谢物阻遏；酶合成的诱导导2.2.提高酶产量的策措施有哪些？提高酶产量的策措施有哪些？3.3.试述发酵过程中对溶解氧进行控制的必要性及其依试述发酵过程中对溶解氧进行控制的必要性及其依据。据。4.4.影响酶生

16、物合成模式的主要因素是什么？影响酶生物合成模式的主要因素是什么？5.5.优良优良(yuling)(yuling)产酶菌种应具备哪些条件？产酶菌种应具备哪些条件？第二十三页，共二十五页。第三章第三章作业作业(zuy)：1.1.概念：外植体；愈伤组织；微载体培养概念：外植体；愈伤组织；微载体培养(piyng)(piyng)2.2.论述植物细胞培养产酶的条件控制。论述植物细胞培养产酶的条件控制。3.3.动物细胞培养的特点有哪些？动物细胞培养的特点有哪些？4.4.举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。第二十四页，共二十五页。内容(nirng)总结植物细胞(xbo)结构。植物细胞(xbo)动物细胞(xbo)微生物细胞(xbo)。植物细胞(xbo)和微生物细胞(xbo)的营养要求较简单。应用最广的是MS培养基和LS培养基。MS培养基是1962年为烟草细胞(xbo)培养而设计的培养基。P82表3-3。外植体细胞(xbo)的获取细胞(xbo)培养分离纯化产物。用70%-75%乙醇，0.1%升汞消毒，无菌水漂洗。细胞(xbo)悬浮培养：转新培养基，在生物反应器中进行培养。2.酶工程的主要任务和主要内容是什么。4.举例说明动物细胞(xbo)培养产酶的工艺过程第二十五页，共二十五页。