单元(扩充)繁殖生物技术4315.pptx

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1、单元（扩充）繁殖生物技术 Bio-Tec of Reproduction第一节 体外受精第二节 发情控制第三节 其它繁殖生物学技术第一节 体外受精 体外受精是指卵母细胞与精子在体外融合，形成合子的过程。体外受精成功的标志是通过移植产生后代。卵母细胞：体内；体外 精子：体外获能一、卵母细胞1、体内成熟卵母细胞 1）超数排卵：（略，胚胎移植讲）2）卵母细胞采集：在内窥镜的导引下，穿刺成熟卵 泡，从卵泡中抽吸卵泡液和成熟卵母细胞。3）镜检：将吸取的卵泡液及卵母细胞置于评皿中，在 体视显微镜下（25X），选则合格的卵母细胞，用 于体外受精。合格卵母细胞标准：放射冠细胞扩散良好，质地均一，放射冠细胞间透

2、明；透明带清晰；卵母细胞圆形，直径大小适中，细胞质质地均匀，色泽柔和，透明度适中（图1）。2、体外成熟的卵母细胞1）卵母细胞来源（1）卵巢来源：从屠宰 场宰杀的母畜获得卵巢，38 C生理盐水中保温，宰杀后 2 小时内运回实 验室。图1 成熟卵母细胞图 （2）采集卵母细胞卵丘细胞复合物：用 38 C 生理盐水洗涤卵巢 2 次，左手持卵巢，右手持注射器，如图所示，抽取 35mm 卵泡 的卵泡液及卵母细 胞卵丘细胞复合 物，置于20ml试管 内，静置待检。选择 35 mm 卵泡的原因是：更 大卵泡的闭锁比例 可能例高，更小卵 泡的发育程度可能 低。图2 卵母细胞卵丘细胞复合物采集 示意图 生理盐水配

3、方：NaCl 18g，Mill-Q（或三蒸水）2l，青霉素2,000,000IU，链霉素2g。（3）镜检卵母细胞卵丘复合物：用吸管吸取经静置 后试管底部的混合物于平皿中，用吸管铺平，在实体显微镜下用吸管检出卵母细胞卵丘复合物，置于另一平皿中，用洗涤液在实体显微镜下洗涤2次，在洗涤过程中要剔除不合格的卵母细胞卵丘复合物。选择合格的卵母细胞卵丘复合物非常重要，否则将降低卵母细胞的成熟比例。卵母细胞卵丘复合物分类标准 a、分类依据：卵母细胞的直径、形状、质地的均匀度、色泽；透明带的完整性；卵丘细胞围绕卵母细胞的完整性、数量、扩散程度、色泽。一般分为4级，1、2级为合格；3、4级为不合格。一级：卵母细

4、胞：直径120m，圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密、完整，质地均匀。二级：卵母细胞：直径120m，圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密，但不完 整，质地均匀。三级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地均 匀。卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、不完整，质地均匀。四级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地不 均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、不完整，质地不均匀。（4）卵母细胞卵丘复合物体外成熟 体外成熟大多采取液滴或试管培养。液滴培养的 优点是培养液不蒸发，渗透压稳定，缺点是培养液中 的脂溶性物质能溶于覆盖的石蜡油；试管培养的缺点是培养液容易蒸发而

5、致渗透压提高。一般来说，采用液滴培养普遍，因此，这里介绍液滴培养。a、制作体外成熟培养液滴 在一次性利用的平皿（36cm）中，用加样器整 齐、小心地加入液滴（大多采用50l液滴），然后用 石蜡油覆盖，在CO2培养箱中平衡2小时（图3）。b、培养 牛：在平衡后的每个液滴中用吸管加入510个卵母细胞卵丘复合物，39 C、5 CO2、湿润环境中培养24小时，卵母细胞成熟，细胞核达到第二次减数分裂。猪：在平衡后的每个液滴 中用吸管加入 510 个卵 母细胞卵丘复合物，在 39 C、5 CO2、湿润环 境中培养4048小时，卵 母细胞成熟，细胞核达到 第二次减数分裂。c、成熟卵母细胞的检查 外观检查：卵

6、母细胞在成熟过程中，卵丘细胞扩散，因此，卵丘细胞扩散，说明卵母细胞可能成熟（图4）。卵母细胞核成熟：在卵母 图3 液滴示意图 细胞成熟过程中，卵母细胞启动第一次减数分裂，依据其核型进行鉴定。在成熟过程中，核型可分为核膜期、染色质浓缩期、核膜消失期、第一次减数分裂中期、第一次减数分裂后期、第二次减数分裂中期。各期特点如下（图5）：核膜期：经染色后可见完整的核膜。染色质浓缩期：染色质染色很深、均一，此为卵 母细胞已经启动第一次减数分裂。核膜消失期：核膜从断续到完全消失。第一次减数分裂中期：染色体分为两组。此时标 志着卵母细胞核已经成熟。第二次减数分裂中期：染色体分为两组，可见第 一极体。卵母细胞质

7、成熟：细胞质成熟较难鉴定，因此，通常 只检查细胞核的成熟。卵母细胞核染色（图6）制片：压片。固定：固定液 乙醇：乙酸3：1，24h 染色：1地衣红，40乙酸 镜检：光学显微镜图6 制片、固定、染色 示意图 液体制备 二、精子体外获能1、牛冷冻精液：Swimming-up2、猪精液：高Ca离子孵化3、绵羊精液：肝素羊血清孵育法三、体外受精1、制备体外受精液滴：3515 l液滴2、体外受精：10卵子，加获能精子至106精子/ml3、培养：5%CO2，38 C 培养12小时。谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH