基因探针-分子杂交技术.ppt

《基因探针-分子杂交技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因探针-分子杂交技术.ppt（18页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、基因探针基因探针 分子杂交技术分子杂交技术基因探针v基因探基因探针针，即核酸探，即核酸探针针，是一段，是一段带带有有检测标记检测标记，且且序列序列已知的，与目的基因互已知的，与目的基因互补补的核酸序列的核酸序列(DNA或或RNA)。分子杂交技术的分类v根据其检测对象不同，可分为根据其检测对象不同，可分为基本操作程序印迹将将样品在凝胶品在凝胶上分离，然后上分离，然后将将样品通品通过“影印影印”的方式的方式转移到固相支移到固相支持物上（如持物上（如滤膜）。膜）。杂交将已印迹有将已印迹有样品的品的滤膜与膜与带有放射性有放射性标记或其它或其它标记的的探探针进行行杂交。交。结果检测通通过放射自放射自显影

2、或影或显色反色反应，判断判断样品中是品中是否有与探否有与探针同同源的分子。源的分子。Southern杂交检测样品检测样品DNA的处理的处理电泳分离及变性处理电泳分离及变性处理转移并固定到滤膜上转移并固定到滤膜上探针的制备及杂交探针的制备及杂交检测与分析检测与分析检测样品DNA的处理v提取检测样品的基因组提取检测样品的基因组DNAv用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段片段电泳分离及变性处理v琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段片段v变性处理变性处理v通常通常DNA变性的方法：变性的方法：热变热变性性、酸酸碱碱变变性性、化学化学试剂变

3、试剂变性性在在0.4MNaOH碱性条件下变性碱性条件下变性凝胶凝胶0.4MNaOH转移并固定到滤膜上v通过毛细管虹吸法，将凝胶上的通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射将将DNA固定在滤膜上固定在滤膜上。转移的方法v毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法探针的制备v一、探针的合成vPCR、化学合成等方法v二、探针的标记v同位素：3H、3535S、3232P等v非同位素：地高辛、生物素、荧光素等地高辛地高辛：可以与可以与可以与可以与dCTPdCTPdCTPdCTP连接成连接成

4、连接成连接成地高辛地高辛地高辛地高辛-dCTP-dCTP-dCTP-dCTP 原理：原理：地高辛地高辛+抗地高辛抗体抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）（带有荧光素或酶的标记）杂交v预杂交：预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。v杂交：杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸在滤膜上。洗膜：洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。安装杂交管

5、安装杂交管杂交炉杂交炉检测与分析v1 1、放射自显影：适用于放、放射自显影：适用于放射性射性同位素标记的探针同位素标记的探针v2 2、比色或、比色或化学发光化学发光检测：检测：适于非适于非同位素标记的探针同位素标记的探针v通过放射自显影或生化检通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的存在与探针同源的DNADNA分子分子及其分子量。及其分子量。Northern杂交v1 1、检测、检测对象为对象为RNARNA。v2 2、与、与SouthernSouthern杂交不同的是：杂交不同的是：1 1）不需）不需要限制性核酸酶切；要限制性核酸酶切；2 2）变性方法不

6、是碱）变性方法不是碱变性，而是采用化学试剂变性法。变性，而是采用化学试剂变性法。v3 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知、主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异的特异mRNAmRNA的表达水平，或比较不同组的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。织或细胞的同一基因的表达情况。Western杂交v1、基本原理和基本、基本原理和基本过过程与程与Southern杂交杂交基本相同基本相同v2、检测对象为蛋白质（或酶）检测对象为蛋白质（或酶）v3、SDS-PAGE电泳分离电泳分离v4、用用“抗体抗体-抗原抗原”免疫反应或免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。