生化工程实习..ppt

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1、生化工程實習(PROTEIN)實驗二實驗二 蛋白質分子量測定蛋白質分子量測定-SDS-聚丙聚丙 烯醯胺凝膠電泳烯醯胺凝膠電泳一、實驗目的：1.學習SDS-PAGE測定蛋白質分子量的原理2.掌握SDS-PAGE測定蛋白質分子量的操作方法二、實驗原理：1.Stokes方程式2.電泳只需兩件儀器：(1).直流電源(2).緩衝劑容器(貯池)系3.SDS-PAGE是PAGE的一種特殊型式，SDS是帶負電荷的陰離子去污劑。4.各種蛋白質分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分離。5.電泳技術的廣泛應用已需要發展一種方法來用在看見大分子在丙烯醯胺膠上分離，方法如下：(1).Coomassie亮藍染色

2、(2).螢光染色技術三、實驗儀器：1.夾心式垂直板電泳槽凝膠模(1351001.5mm)2.直流穩壓電源(電壓300600V，電流50100mA)四、實驗藥品及試劑：1.分子量測定標準蛋白質2.連續體系SDS-PAGE有關試劑(1).0.2MpH7.2磷酸鹽緩衝液：(2).樣品溶解液：(3).凝膠貯液：(4).凝膠緩衝液：(5).1%TEMED：(6).10%過硫酸銨(AP)：(7).電極緩衝液(0.1%SDS，0.1MPH7.2磷酸鹽緩衝液)：(8).1%瓊脂醣：3.不連續體系SDS-PAGE有關試劑(1).10%(W/V)SDS溶液：(2).1%TEMED(V/V)：(3).10%過硫酸銨

3、(AP)(W/V)：(4).樣品溶解液：(5).凝膠貯液：(6).凝膠緩衝液：(7).電極緩衝液(內含0.1%SDS，0.05MTris-0.384M甘胺酸緩衝液PH8.3)：(8).1%瓊脂醣：4.固定液：5.染色液：6.脫色液：五、實驗步驟：(一)、實驗步驟(一)：1.安裝夾心式垂直板電泳槽2.配膠及凝膠板的製備(1).配膠(2).凝膠板的製備3.樣品的處理與加樣(1).樣品的處理(2).加樣4.電泳5.凝膠板剝離與固定6.染色與脫色7.繪製標準曲線(二)、實驗步驟(二)：蛋白質電泳-11.養菌菌液(100L)+LB(100mL)+Amp(100L)+IPTG(100L)(1).配製培養基

4、200mL利用250mL錐形瓶(2).調整PH值(PH=7.0)(3).分裝於2瓶錐形瓶(每瓶錐形瓶100mL)，並於每瓶錐形瓶用鋁鉑封口。(4).置於滅菌鍋滅菌，操作時間約1小時(5).滅完菌後，取出冷卻(6).於錐形瓶中加入100L的菌種、100L的Amp及100LIPTG.(於無菌操作台操作)(7).置於恆溫振盪器中培養16小時蛋白質電泳-21.養菌：菌液(100L)+LB(100mL)+Amp(100L)+IPTG(100L)2.離心，上層液不要，取下層沈澱物。3.每支有沈澱物的離心管中加5mL磷酸緩衝液(Pibuffer)溶解沈澱物用玻棒溶解沈澱物4.溶解沈澱物均勻後，利用超音波震破

5、機震破細胞的細胞壁若酵素為胞外酵素，則不需此程序；若酵素為胞內酵素，則需此程序將沈澱物震破，以能取出胞內酵素5.震破完後，離心，取上層液(即為酵素液)而下層為細胞壁的殘骸，則滅菌後丟棄6.上層液，測酵素活性：(1).活性測試法：.先取5支1.5mL的離心管，每支加入200uL膠狀chitin。.離心完成後，先在25支加入800uL上層液(酵素液)，將25置入37恆溫槽(維持酵素有活性)，並開始記時。.而第1支(當Blank用)則加入800uL的上層液(酵素液)，並加入200uL的DNS溶液，置入95恆溫槽(破壞酵素活性)，反應10min。.其餘25支置入37恆溫槽，每30分鐘取1支出來，再加入

6、200uLDNS溶液，在95反應10min，其餘以此類推。.觀察是否有顏色變化，若愈來愈深的話表示此酵素液中含有此酵素。7.酵素純化8.跑蛋白質電泳(SDS-PAGE)(1).gel之配製.玻璃置入組合架上，螺絲對角鎖緊.裝入支撐架上，螺絲向內，有一響聲.測試是否有漏水，水裝至小玻璃頂端，若沒有漏水，則將水倒掉，再用拭鏡紙將水吸乾。.依配方配製好runninggel後，倒入大小玻璃之夾縫中，液位約在組合架凹洞的底端。.再加入n-butanol用以壓平gel的液面.待gel凝固後，則倒掉n-butanol後，可用水沖洗，再用拭鏡紙吸乾gel之液面水分.將配製好的stackinggel倒入大小玻璃

7、的夾縫中(不能有氣泡)TEMED最後加入，再立即倒入，否則stackinggel很容易凝固.立刻置入齒梳，愈接近runninggel愈好。.凝固後(可用烘箱)，取出組合架，置入電泳槽中.槽中需放有4Xrunningbuffer.將置入槽中之組合架中的gel之齒狀凹洞中，用注射筒吸取runningbuffer清洗每個齒狀凹洞。.一切就緒後，開始注入處理過的sample及markerA.各管取30Lsample置入1.5mLtube中，再加入5L之5XsamplebufferB.輕微離心C.取5L之proteinmarkerD.各管置入drybath952minE.取出，預備注入膠片之溝槽中註：m

8、arker在注入溝槽時，可能因加熱過程中損失，可加入runningbuffer稀釋，再注入溝槽中。.注射完後，將組合架之電極蓋上，紅-紅；黑-黑。Powersupply之使用：A.開powerB.按enterC.按memoryD.按1E.按1F.按enterG.按start.按完後，即可開始進行SDS-PAGE.SDS-PAGE執行完，由兩片玻璃間拆下gel，要小心，盡量不要使gel破掉。.將gel(此時沒有band)置入含有stainsolution的盤子中，約1小時的震盪搖晃。.將stainsolution回收，再倒入destainsolution於盤子中，震盪搖晃一段時間，觀察是否有band產生，若沒有則再換掉destainsolution繼續，直至有band產生，即可停止。.可利用膠片觀察箱，估算band之分子量。