第五章细胞的原代与传代培养.ppt

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1、第五章第五章细胞的原代与传代培养细胞的原代与传代培养n一、原代培养一、原代培养 概念：概念：取自体内新鲜组织并置于体外条取自体内新鲜组织并置于体外条 件下生长的细胞在传代之前称为件下生长的细胞在传代之前称为 原代培养原代培养。原代培养技术的重要意义原代培养技术的重要意义:n原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。而且大多数细胞表现出原来组织的特性。n利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学

2、方面的试验效果很好。分化及病毒学方面的试验效果很好。n原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。的阶段。原代培养原代培养 消化法：消化法：这种培养过程主要是采用无菌操作的这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。条件下培养，使其不断地生长和繁殖。消化法消化法贴块法贴块法冷消化冷消化温消化温消化一次性消化一次性消化分次消化分次消化贴块法贴块法消化法消化法原原代代培培养养

3、方方法法分分类类93分次消化分次消化 消化法的分类消化法的分类解离释放细胞的方法解离释放细胞的方法 n最常用的是机械解离细胞法、最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞酶学解离细胞法法以及螯合剂解离细胞法。以及螯合剂解离细胞法。n用用酶学解离细胞法酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动物解离细胞是体外培养动物细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化酶是酶是胰蛋白酶和胶原酶胰蛋白酶和胶原酶两种。两种。动物细胞原代培动物细胞原代培养流程的示意图养流程的示意图 器材和液体的准备器材和液体的准备n n细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的

4、玻璃器材 培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，干热或湿热灭菌后备用和铁筒中，干热或湿热灭菌后备用和铁筒中，干热或湿热灭菌后备用和铁筒中，干热或湿热灭菌后备用n n手术器材、瓶塞等手术器材、瓶塞等手术器材、瓶塞等手术器材、瓶塞等 15151515磅，磅，磅，磅，121121121121，20202020分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌n nDMEMDMEM培养液、消化液、培养液、消化液、培养液、消化液、培养液、消化液、PBSPBS液等液等液等液等 用滤器过

5、滤后备用用滤器过滤后备用用滤器过滤后备用用滤器过滤后备用方法与步骤（举例方法与步骤（举例:心肌细胞消化培养法）心肌细胞消化培养法）（1 1）动物处死：）动物处死：将出生将出生2 23d3d乳鼠，用拉颈椎方法乳鼠，用拉颈椎方法处死。腹部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球处死。腹部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球擦拭腹部消毒。擦拭腹部消毒。（2 2）剪取心脏：）剪取心脏：在无菌条件下将心脏（心尖）取在无菌条件下将心脏（心尖）取出，置于无菌培养皿中，用出，置于无菌培养皿中，用HanksHanks液洗涤液洗涤1-21-2次去次去除血污；放入另一培养皿中，纵向剪开心脏，仔除血污；放入另一培养皿中，纵向剪开

6、心脏，仔细去除心腔内血污后剪成细去除心腔内血污后剪成1mm1mm3 3大小的组织块，再大小的组织块，再并用并用HanksHanks液洗涤液洗涤2 23 3次，直到液体澄清。次，直到液体澄清。（3 3）消化及分散组织块：）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无将上述清洗过的组织放入无菌三角烧瓶内，加入菌三角烧瓶内，加入5 56 6倍量的倍量的0.10.1胰蛋白酶液胰蛋白酶液（pH7.4 pH7.4 7.6 7.6），置），置3737恒温磁力搅拌器上分次恒温磁力搅拌器上分次消化：每次消化消化：每次消化8-108-10分钟。在超净台中吸出胰蛋白分钟。在超净台中吸出胰蛋白酶液于带盖离心管中，加入酶

7、液于带盖离心管中，加入2 2滴血清终止消化。直到滴血清终止消化。直到组织块基本消化完全。组织块基本消化完全。各管配平后离心，收集细胞，无血清培养液洗各管配平后离心，收集细胞，无血清培养液洗2-32-3次后，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧次后，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。杯中。（4 4）计数与稀释：）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出从过滤的细胞悬液中取出1ml1ml滴于滴于血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30 30 5050万个细胞为宜。万个细

8、胞为宜。（5 5）分装与培养：）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶中，盖好瓶盖，在培养瓶上做好标记，置于培养瓶中，盖好瓶盖，在培养瓶上做好标记，置于3737的的COCO2 2培养箱中培养。培养箱中培养。（6 6）观察：）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。传代培养。原代细胞培养结果原代细胞培养结果:n n细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长开始生长n n如接种的细胞密度适宜，如接种

9、的细胞密度适宜，5 5天到一周即可天到一周即可形成单层形成单层贴块培养步骤图解贴块培养步骤图解 细胞原代贴块培养法细胞原代贴块培养法 VSMCs原代培养第原代培养第4天和第天和第9天（天（100）二、传代细胞培养二、传代细胞培养n n细胞细胞“一代一代”指从细胞接种到分离再培养的一指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞倍增细胞倍增3 36 6次次n离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养

10、，细胞将逐渐衰老死亡。及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。n传代培养是指细胞从一个培养瓶以传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:21:2或或1:31:3比比率转移，接种到另一培养瓶的培养。率转移，接种到另一培养瓶的培养。n贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代。把细胞分散成单细胞再传代。n悬浮型生长细胞则用悬浮型生长细胞则用直接传代法直接传代法或或离心法传代离心法传代。方法与步骤方法与步骤（一）贴壁细胞传代培养（一）贴壁细胞传代培养（1 1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，

11、倒去瓶中的旧培养液，加入旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2 23ml3ml的的D-D-Hanks Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在 细胞表面的碎片细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？思考：还有什么作用？）（2 2）加入适量）加入适量0.0.0.25 0.25胰蛋白酶消化液，胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收 缩突起出现空隙时，倒去酶液。缩突起出现空隙时，倒去酶液。（3 3）用）用HanksHanks液洗涤液洗涤1 1次，加入适量培养液，反复吹次，加入适量培养液，反复吹 打细胞，使其成细胞悬液

12、。打细胞，使其成细胞悬液。（4 4）以）以1 1：2 2或或1 1：3 3进行分装，并在培养瓶上做好标进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀，记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 CO 37 CO2 2 培养箱培养。培养箱培养。（5 5）观察：细胞培养）观察：细胞培养24h24h后，即可观察培养液的颜后，即可观察培养液的颜 色及细胞的生长情况。色及细胞的生长情况。VSMCs传代培养第传代培养第1天和第天和第3天（天（100）（二）悬液细胞的传代培养（二）悬液细胞的传代培养（1 1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管 把培养瓶中的

13、细胞吹打均匀。把培养瓶中的细胞吹打均匀。（2 2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离 心（心（1 000r/min1 000r/min）5min5min。（3 3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养 液，用吸管吹打细胞，制成悬液。液，用吸管吹打细胞，制成悬液。（4 4）以）以1 1：2 2或或1 1：3 3进行分装，并在培养瓶上做好标进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀，记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 CO37 CO2 2培培 养箱培养。养箱培养。（5 5）观察：细胞培养）

14、观察：细胞培养24h24h后，即可进行观察。后，即可进行观察。传代细胞培养结果传代细胞培养结果n n一般情况，传代后的细胞在一般情况，传代后的细胞在2 2小时左右小时左右就能附着在培养瓶壁上，就能附着在培养瓶壁上，2 24 4天就可天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代在瓶内形成单层，需要再次进行传代n三、人体活检三、人体活检(或手术或手术)材料材料n(1)(1)在准备以临床材料为实验材料时在准备以临床材料为实验材料时,要预先与临要预先与临床外科医生和护士商量床外科医生和护士商量,并做好一切必要的准备工并做好一切必要的准备工作。争取拿到作。争取拿到新鲜、无菌、少坏死新鲜、无菌、少坏死的标本。的

15、标本。n(2)(2)与临床联系好手术时间后，立即做好如下准备与临床联系好手术时间后，立即做好如下准备工作：准备好工作：准备好1-21-2个贮有培养液和抗生素的标本收个贮有培养液和抗生素的标本收集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送往医院，并与医生和护士讲清截取手术标本的部往医院，并与医生和护士讲清截取手术标本的部位及注意事项。位及注意事项。n(3)(3)标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往组织培养实验室。工作人员最好是等在手术

16、间外。组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。但有时手术时间难以掌握。则请护士但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料将收集材料的瓶子盖好后，放入的瓶子盖好后，放入44冰箱，冰箱，尽快打电话通知尽快打电话通知工作人员。工作人员。n(4)(4)取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制污染。如手术标本比较大（约污染。如手术标本比较大（约200mg200mg以上），可以上），可将其浸于将其浸于70%70%酒精中约酒精中约30-6030-60秒，这样会减少表面秒，这样会减少表面

17、污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。n需要注意的事项：需要注意的事项：n整个取材过程中，都要注意整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润保持组织的湿润，随，随时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般情况下，最好是使用冰冷的液体。情况下，最好是使用冰冷的液体。n在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪，在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪，防止以钝器对组织揉、捻、撕、拉等而造成细胞防止以钝器对组织揉、捻、撕、拉等而造成细胞损伤。损伤。n整个取材过程整个取材过程耗时越短越好耗时越短越好。在万不得已的情况。在万不得已的情况下，取材后也可将组织贮存在冷的下，取材后也可将组织贮存在冷的(4)(4)含平衡盐含平衡盐溶液溶液(或其它缓冲盐溶液或其它缓冲盐溶液)的营养液中，最好的营养液中，最好不超不超过过242448h48h(视不同组织类型而定视不同组织类型而定)。