纸层析法分离鉴定氨基酸.ppt

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1、将样品点在距滤纸一端约将样品点在距滤纸一端约23cm的某一处，的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配。由于分配系数（酸在两相中不断分配。由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置，可用物质被分离后在纸层析图谱上的位置，可用比移值（比移值（Rf）来表示。）来表示。所谓所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（

2、停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与）与原点至溶剂前沿的距离（原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。如图）的比值。如图在一定条件下（如温度、在一定条件下（如温度、展层剂的组成、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某种物质的层析纸质量等不变），某种物质的Rf值是常值是常数，因此可作为定性依据。数，因此可作为定性依据。由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。本实基酸层析斑点显色，从而作定性分析。本实验利用纸层析法分离氨基酸。验利用纸层析法分离氨基酸。三、操作三、操作l1.在在层层析缸中装入展析缸中装入展层剂层剂，其高度，其高度约约1.

3、52cm。l2.准备滤纸准备滤纸:戴上手套，取戴上手套，取层层析析滤纸滤纸（长长22cm、宽宽14cm）一）一张张，在，在纸纸的一端距的一端距边缘边缘3cm处处用用铅铅笔画一笔画一条直条直线线，在此直，在此直线线上每上每间间隔隔2cm作一作一记记号，号，为为点点样样位置（即原点），如位置（即原点），如图图。注意事注意事项项：手不能直接接手不能直接接触触滤纸滤纸；直；直线线与底与底边边平行。平行。l3.点点样样：用毛用毛细细管依次将管依次将Lys(赖赖)、Gly(甘甘)、Pro(脯脯)、Val(缬缬)、Leu(亮亮)和混合和混合样品样品分分别别点在点在这这6个个位置上，点位置上，点样样点干后再点

4、一次。注意每点在点干后再点一次。注意每点在纸纸上上扩扩散的直径，最大不超散的直径，最大不超过过3mm。纸层析点样标准图纸层析点样标准图 LysGlyProValLeu混合样品混合样品l4、展层：展层：将点好样的滤纸将点好样的滤纸(点样面朝外点样面朝外)卷成筒卷成筒状，用透明胶纸粘接或用线缝好，纸的两边不能状，用透明胶纸粘接或用线缝好，纸的两边不能接触。将滤纸直立于层析缸中（接触。将滤纸直立于层析缸中（注意：注意：点样的一点样的一端在下，展层剂的液面需低于点样线端在下，展层剂的液面需低于点样线1cm，滤，滤纸勿与缸壁接触），纸勿与缸壁接触），盖好层析缸盖，进行盖好层析缸盖，进行展层展层。待溶剂上

5、升待溶剂上升1520cm时，取出滤纸，用铅笔描时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，电吹风吹干。出溶剂前沿界线，电吹风吹干。5、显显色：色：用用喷雾喷雾器均匀器均匀喷喷上上0.1水合水合茚茚三三酮酮正丁醇溶液，然后用正丁醇溶液，然后用电吹风吹干电吹风吹干即可即可显显出各出各层层析斑点。析斑点。卷成筒状的滤纸卷成筒状的滤纸氨基酸显色后的图谱氨基酸显色后的图谱 溶剂前沿溶剂前沿XY四、计算：四、计算：用直尺测量并计算出各种氨基酸的用直尺测量并计算出各种氨基酸的Rf值。值。样品样品aa标准标准aaRf混合混合aaRf赖氨酸赖氨酸甘氨酸甘氨酸脯氨酸脯氨酸缬氨酸缬氨酸亮氨酸亮氨酸试剂试剂和器材：和器材：1.试剂试剂：(1)氨基酸溶液：氨基酸溶液：0.5%(m/V)的的赖赖氨酸、脯氨酸、氨酸、脯氨酸、缬缬氨氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们们的混合液的混合液(各各组组分的分的浓浓度均度均为为0.5)。(2)展展层剂层剂：正丁醇：正丁醇 冰醋酸冰醋酸 水水4 1 3(V/V)。(3)显显色色剂剂：0.1(m/V)水合水合茚茚三三酮酮正丁醇溶液正丁醇溶液。2.器材：器材：层层析缸；析缸；层层析析滤纸滤纸（新（新华华一号）；毛一号）；毛细细管管;喷雾喷雾器；器；电电吹吹风风；直尺；直尺；铅铅笔；笔；针线针线或透明胶或透明胶带带；一次性手套；一次性手套。