第4章--基因工程的主要技术及其原理概要.ppt

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1、第第四四章章 基因工程的主要技术及其原理基因工程的主要技术及其原理第一节第一节 DNADNA和和RNARNA的提取与纯化的提取与纯化一一 DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法（一）（一）DNA提取的基本原理提取的基本原理DNA的性质：的性质：1)DNA是极性化合物，不溶于有机溶剂，溶于水，在水中溶解度达是极性化合物，不溶于有机溶剂，溶于水，在水中溶解度达10g/L，其钠盐比游离态更易溶于水。在酸性溶液中易水解，在中，其钠盐比游离态更易溶于水。在酸性溶液中易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。性或弱碱性溶液中较稳定。2)DNA与核蛋白复合体与核蛋白复合体DNP在在低盐浓度（在在低盐浓度（

2、0.1mol/L NaCl）溶液中）溶液中溶解度最低（为水中的溶解度最低（为水中的1%），在高盐浓度（），在高盐浓度（1mol/L NaCl）溶液中）溶液中溶解度较高（为水中的溶解度较高（为水中的2倍），而核糖核蛋白倍），而核糖核蛋白RNP受盐浓度影响较受盐浓度影响较小，在低盐浓度中溶解度仍较大。从而可将小，在低盐浓度中溶解度仍较大。从而可将DNP和和RNP分开。分开。提取和纯化提取和纯化DNA，首先需破碎或溶解细胞，用高盐（，首先需破碎或溶解细胞，用高盐（1mol/L NaCl）将）将DNP抽抽提出来，再把蛋白质、多糖、提出来，再把蛋白质、多糖、RNA及无机离子除去。及无机离子除去。(1).

3、细胞裂解和细胞裂解和DNA的溶解；的溶解；一般采用机械破碎或酶解细胞释放一般采用机械破碎或酶解细胞释放DNA，严防细胞中各种酶对，严防细胞中各种酶对DNA的的 破坏：破坏：1)利用液氮在超低温下研磨，使酶失活；利用液氮在超低温下研磨，使酶失活；2)快速加入缓冲液并迅速混匀，保护快速加入缓冲液并迅速混匀，保护DNA。DNA提取的步骤：提取的步骤：EDTA：螯合螯合DNA酶的辅助因子酶的辅助因子Mg2+和和Ca2+，降低，降低DNA酶活性；酶活性；SDS：变性并降解蛋白质，降低变性并降解蛋白质，降低DNA酶活性；酶活性；抗氧化剂：抗氧化剂：PVP，-巯巯基乙醇，抗坏血酸、半胱氨酸，基乙醇，抗坏血酸

4、、半胱氨酸，DTT降低酚降低酚类类氧化氧化 对对DNA的干的干扰扰 PVP：有效去除酚有效去除酚类和多糖物和多糖物质。(2).与核酸结合的蛋白质及与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除；等杂质的去除；主要利用主要利用DNA与蛋白、多糖性质不同，加入离子变性剂、去污剂使其变性解聚；与蛋白、多糖性质不同，加入离子变性剂、去污剂使其变性解聚；CTAB:十六烷基三甲基溴化铵，可溶解细胞膜，在高盐溶液中（十六烷基三甲基溴化铵，可溶解细胞膜，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）与与DNA结合形成复合物并呈溶解状态，但当浓度降低到一定程度（结合形成复合物并呈溶解状态，但当浓度降低到一定程度（0.3mo

5、l/L NaCl）时，）时，DNA即从溶液中沉淀，通过离心可将即从溶液中沉淀，通过离心可将DNA-CTAB复合物与多糖与复合物与多糖与 蛋白质分开。蛋白质分开。SDS:十二烷基硫酸钠，可使蛋白质变性，核蛋白解聚，使十二烷基硫酸钠，可使蛋白质变性，核蛋白解聚，使DNA游离出来，游离出来，再根据再根据DNA和蛋白质在有机溶剂中溶解度差异，用苯酚和蛋白质在有机溶剂中溶解度差异，用苯酚-氯仿抽提蛋白。氯仿抽提蛋白。苯酚苯酚-氯仿氯仿:对蛋白质具有极强的变性作用，而对对蛋白质具有极强的变性作用，而对DNA无影响。无影响。RNA杂质杂质:用不含用不含DNA酶的酶的RNA酶去除。酶去除。(3).DNA的沉淀

6、与纯化的沉淀与纯化溶解在上清液中的溶解在上清液中的DNA加入加入2倍体积的无水乙醇使其沉淀。倍体积的无水乙醇使其沉淀。在多糖、蛋白含量高时用在多糖、蛋白含量高时用1倍的异丙醇沉淀效果较好。倍的异丙醇沉淀效果较好。（二）（二）DNA提取的几种方法提取的几种方法 根据细胞破碎后，分离根据细胞破碎后，分离DNA与蛋白质所采用的技术策略和试剂不同，可分以下与蛋白质所采用的技术策略和试剂不同，可分以下几种方法：几种方法：1.浓盐法浓盐法原理：根据原理：根据RNP和和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。方法方法1：用：用1mol/L NaCl抽提，得到的抽提，得到

7、的DNP液中加入含辛醇的氯仿，离心，液中加入含辛醇的氯仿，离心，DNA位于位于 上层水相，回收水相，用上层水相，回收水相，用2倍体积的倍体积的95%乙醇或无水乙醇将乙醇或无水乙醇将DNA沉淀出来。沉淀出来。方法方法2：用：用0.15mol/L NaCl反复洗涤细胞裂解液除去反复洗涤细胞裂解液除去RNP，再用，再用1mol/L NaCl抽提抽提DNP，然后用氯仿然后用氯仿-异戊醇除去蛋白。异戊醇除去蛋白。以稀盐溶液提取以稀盐溶液提取DNA，可加入适量，可加入适量SDS使蛋白质变性解聚，使使蛋白质变性解聚，使DNA解离；解离；使用使用SSC溶液（溶液（5mol/L NaCl、0.015mol/L柠

8、檬酸钠）抑制柠檬酸钠）抑制DNase降解降解DNA2.SDS法法原理：原理：SDS使细胞膜裂解，使蛋白质变性，将蛋白质和多糖等杂质与使细胞膜裂解，使蛋白质变性，将蛋白质和多糖等杂质与DNA分开，分开，加入乙酸钾可使加入乙酸钾可使SDS-蛋白复合物转变成溶解度更小的钾盐，使沉淀更加完全。蛋白复合物转变成溶解度更小的钾盐，使沉淀更加完全。3.CTAB法法原理：在细胞裂解液中，加入原理：在细胞裂解液中，加入CTAB分离缓冲液，将分离缓冲液，将DNA溶解出来。再经氯仿溶解出来。再经氯仿-异戊醇异戊醇 抽提除蛋白，即可得到含抽提除蛋白，即可得到含DNA水相，经乙醇或异丙醇沉淀即得到水相，经乙醇或异丙醇沉

9、淀即得到DNA。4.苯酚抽提法苯酚抽提法原理：苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制原理：苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制DNA酶的降解作用，用苯酚处理细胞匀浆液，酶的降解作用，用苯酚处理细胞匀浆液，蛋白分子溶于酚相，蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相，离心分层取水相，多次重复，合并水相，溶于水相，离心分层取水相，多次重复，合并水相，用乙醇沉淀，即得到用乙醇沉淀，即得到DNA。5.水抽提法水抽提法原理：利用核酸溶于水的性质，用低盐除去原理：利用核酸溶于水的性质，用低盐除去RNA，将沉淀溶于水中，使，将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解，充分溶解，离心后收集上清液，加入固体离心后收集上清液，加入固体NaCl调至

10、调至2.6mol/L，加入，加入2倍体积的倍体积的95%乙醇，乙醇，然后，分别用然后，分别用66%，80%，95%乙醇及丙酮清洗乙醇及丙酮清洗DNA，经干燥后即得，经干燥后即得DNA样品。样品。在强碱环境中，大分子量的核在强碱环境中，大分子量的核DNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNA仍仍为自然状态。将为自然状态。将pH调至中性并在高盐环境中，核调至中性并在高盐环境中，核DNA之间交联形之间交联形成不溶性网状结构，但质粒成不溶性网状结构，但质粒DNA仍然呈可溶状态。仍然呈可溶状态。碱裂解法提质粒碱裂解法提质粒DNA的原理：的原理：（三）质粒的提取（三）质粒的提取二二 RNA提取的基

11、本原理与方法提取的基本原理与方法（一）总（一）总RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法1.总总RNA提取的原理提取的原理真核生物真核生物RNA分子主要存在于细胞核与细胞质中。分子主要存在于细胞核与细胞质中。总总RNA：rRNA，tRNA，mRNA。其中。其中mRNA仅占总仅占总RNA的的1-5%，分子大小不等，由几百乃至数万核苷酸组成。分子大小不等，由几百乃至数万核苷酸组成。能否成功提取能否成功提取RNA，关键在于能否完全抑制或除去，关键在于能否完全抑制或除去RNA酶的破坏作用，酶的破坏作用，获取完整的全长获取完整的全长RNA分子。分子。RNA酶有一条多肽链组成，不需要任何辅助因子，存

12、在十分广泛并十分稳定，酶有一条多肽链组成，不需要任何辅助因子，存在十分广泛并十分稳定，非常耐热，在较宽的非常耐热，在较宽的pH范围内有活性，及其顽固。范围内有活性，及其顽固。1）所有玻璃器皿应置于）所有玻璃器皿应置于180烘箱烘烤烘箱烘烤4小时以上；凡是不能烘烤的材料如塑料制小时以上；凡是不能烘烤的材料如塑料制品需用品需用01%的的DEPC（二乙基焦碳酸盐）溶液处理，然后（二乙基焦碳酸盐）溶液处理，然后121 高压消毒高压消毒40分钟；分钟；2)全部过程需戴手套、口罩操作，并经常更换手套；全部过程需戴手套、口罩操作，并经常更换手套；3)RNA电泳漕需用去污剂洗涤，用水冲洗干净后，用乙醇干燥，浸

13、泡于电泳漕需用去污剂洗涤，用水冲洗干净后，用乙醇干燥，浸泡于3%的的H2O2水溶液中，室温水溶液中，室温10分钟后，再用分钟后，再用0.1%DEPC水彻底冲洗。水彻底冲洗。提取提取RNA的实验必须采取以下措施：的实验必须采取以下措施：1）细胞的有效破碎，尤其是植物细胞带有细胞壁，研磨要彻底；）细胞的有效破碎，尤其是植物细胞带有细胞壁，研磨要彻底；2)使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放到溶液中；使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放到溶液中；变性剂有异硫氰酸胍、变性剂有异硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸钠等；十二烷基肌氨酸钠等；3)有效地抑制内源及外源有效地抑制内源及外源RNase活性；活性

14、；4)将将RNA与与DNA、蛋白质和多糖分开。策略一是先提总核酸，再用氯化锂将、蛋白质和多糖分开。策略一是先提总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；策略二是直接在酸性条件下用酚沉淀出来；策略二是直接在酸性条件下用酚-氯仿抽提，低氯仿抽提，低pH的酚将使的酚将使RNA进入进入水相，而蛋白质和水相，而蛋白质和DNA留在有机相中，水相中的留在有机相中，水相中的RNA可用异丙醇沉淀出来。可用异丙醇沉淀出来。提取提取RNA的方法一般包括的方法一般包括4个关键点：个关键点：2.总总RNA提取的方法提取的方法(1)酚酚-异硫氰酸胍提取法。异硫氰酸胍提取法。Trizol试剂是最广泛的抽提总试剂是最广泛的抽提总R

15、NA的试剂，即根据酚的试剂，即根据酚-异硫氰酸胍提取法设计。异硫氰酸胍提取法设计。提取步骤：提取步骤：在液氮中研磨样品，使细胞破碎在液氮中研磨样品，使细胞破碎 加入加入Trizol试剂，溶解细胞成分试剂，溶解细胞成分 加入氯仿加入氯仿抽提蛋白，离心分离水相和有机相抽提蛋白，离心分离水相和有机相 收集含收集含RNA的水相的水相 异丙醇沉淀可获得异丙醇沉淀可获得RNA样品。样品。(2)离心分离法。离心分离法。过柱纯化，将含过柱纯化，将含RNA的细胞破碎液加在含硅胶膜的柱子上，通过柱子时，的细胞破碎液加在含硅胶膜的柱子上，通过柱子时，RNA被被硅胶膜吸附，与其他杂质分开，然后在低盐溶液或水中将硅胶膜

16、吸附，与其他杂质分开，然后在低盐溶液或水中将RNA洗脱下列。洗脱下列。（二）（二）mRNA的提取的提取真核生物真核生物mRNA的提取途径有两条：的提取途径有两条：其一：抽提细胞总其一：抽提细胞总RNA，经蛋白酶，经蛋白酶K除蛋白，在利用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸纤除蛋白，在利用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸纤 维维 素柱层析，把素柱层析，把mRNA与与tRNA、rRNA分开。分开。真核生物真核生物mRNA的的3末端带有一串长约末端带有一串长约200个腺苷酸的个腺苷酸的polyA序列，其他序列，其他RNA 没有这样的结构，从而可用没有这样的结构，从而可用polyT将将mRNA结合将其分离。结合将其分离。基因

17、表达具有时空特异性，分离与目的基因时空表达相对应的基因表达具有时空特异性，分离与目的基因时空表达相对应的mRNA是实验成是实验成 功的关键。功的关键。其二：先提多聚核糖体，再将蛋白质与其二：先提多聚核糖体，再将蛋白质与mRNA分开，利用抗原抗体反应，将微量分开，利用抗原抗体反应，将微量 特异的特异的mRNA提取出来。提取出来。二二 DNA或或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定浓度、纯度和相对分子质量的测定 常用的方法有紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法。常用的方法有紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法。（一）紫外分光光度计法测定（一）紫外分光光度计法测定DNA、RNA的浓度和纯度的浓度和纯度 DN

18、A或或RNA链上碱基的苯环结构在紫外区具有较强吸收，吸收峰在链上碱基的苯环结构在紫外区具有较强吸收，吸收峰在260nm处。处。1个个OD260相当于相当于50ug/mL的双链的双链DNA；1个个OD260相当于相当于40ug/mL的单链的单链RNA；蛋白质的最大吸收峰在蛋白质的最大吸收峰在280nm处，多糖的最大吸收峰在处，多糖的最大吸收峰在230nm处。处。对于对于DNA，OD260/OD2801.8，大于，大于1.9表明有表明有RNA污染，小于污染，小于1.6表明表明 有蛋白质、苯酚等的污染。有蛋白质、苯酚等的污染。对于对于RNA,OD260/OD280=1.82.0之间，小于之间，小于1

19、.7表明有蛋白质和苯酚污染，表明有蛋白质和苯酚污染，大于大于2.0表明有异硫氰酸胍残留。表明有异硫氰酸胍残留。（二）琼脂糖凝胶电泳鉴定（二）琼脂糖凝胶电泳鉴定采用琼脂糖凝胶电泳可以粗略鉴定采用琼脂糖凝胶电泳可以粗略鉴定DNA和和RNA的含量和纯度。的含量和纯度。EB(溴化乙锭）：溴化乙锭）：DNA的染色剂。该物质能嵌入核酸分子，并具有在紫外光下的染色剂。该物质能嵌入核酸分子，并具有在紫外光下 发荧光的特性。发荧光的特性。利用利用EB染色的染色的DNA样品的亮度可粗略定量，而通过条带的清晰度判断是否降解样品的亮度可粗略定量，而通过条带的清晰度判断是否降解如果如果DNA有降解，则在电泳图谱上表现出

20、明显的拖尾。有降解，则在电泳图谱上表现出明显的拖尾。一般用常规的琼脂糖凝胶电泳检测总一般用常规的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。的质量。第二节第二节 凝胶电泳凝胶电泳 DNA的等电点偏酸，当处于电泳条件（的等电点偏酸，当处于电泳条件（pH=8）时，）时，DNA链上带有负电链上带有负电荷，在电场力的作用下会向正极泳动，由于荷，在电场力的作用下会向正极泳动，由于DNA链上负电荷的增加伴随着链上负电荷的增加伴随着DNA分子质量的增加而增加。所以，实际上分子质量的增加而增加。所以，实际上DNA分子的荷质比始终是一常数，分子的荷质比始终是一常数，电泳中分离电泳中分离DNA靠的是分子的大小与构型的不同。

21、靠的是分子的大小与构型的不同。一一 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶（一）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持介质，在适当条件下对带电生物大分子进行分离。琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持介质，在适当条件下对带电生物大分子进行分离。琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，是琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，是D-半乳糖和脱水半乳糖和脱水3,6-L-半乳糖连接而成的一种线性半乳糖连接而成的一种线性分子，具有亲水性，不带电，不引起分子，具有亲水性，不带电，不引起DNA变性，不吸附分离物质的特点。变性，不吸附分离物质的特点。凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关。凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关。不同类

22、型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离DNA片段大小范围片段大小范围（二）凝胶电泳的影响因素（二）凝胶电泳的影响因素1、DNA的分子大小。的分子大小。线状双链线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。移得越慢。2、DNA的分子构型。的分子构型。相同分子量的线状、开环和超螺旋相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超超螺旋螺旋DNA移

23、动最快移动最快,而开环而开环DNA分子移动最慢分子移动最慢。3、凝胶浓度。凝胶浓度。一一个给定大小的线状个给定大小的线状DNA分子分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的分子的大小。大小。4、电场强度。电场强度。电压一般不超过电压一般不超过5v/cm，电压高，电泳快，但分辨率低。电压低，电泳慢，但分，电压高，电泳快，但分辨率低。电压低，电泳慢，但分辨率高。辨率高。5、溴化乙锭。溴化乙锭。荧光染料溴化乙啶用于检

24、测琼脂糖凝胶中的荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，使其刚性更强,还会使线状还会使线状DNA迁移率降低迁移率降低15。6、电泳缓冲液。电泳缓冲液。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误如误用蒸馏水配制凝胶用蒸馏水配制凝胶),电导率最小电导率最小,DNA几乎不移动几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中在高离子强度的缓冲液中(如误如误加加10电泳缓冲液电泳缓冲液),则电导

25、很高并明显产热则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或严重时会引起凝胶熔化或DNA变性变性。二二 琼脂糖变性胶电泳琼脂糖变性胶电泳 RNA为单链分子，链内碱基容易配对形成二级结构。不同的为单链分子，链内碱基容易配对形成二级结构。不同的RNA分子空间结构分子空间结构不同，在未变性条件下，其相对分子量与电泳一定距离没有严格的相关性。不同，在未变性条件下，其相对分子量与电泳一定距离没有严格的相关性。常用的常用的RNA变性胶有两种：变性胶有两种：其一为含有乙二醛其一为含有乙二醛-二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSO）的凝胶；）的凝胶；其二为含甲醛的凝胶。其二为含甲醛的凝胶。水平电泳水平电泳三三 聚丙烯

26、酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 垂直电泳垂直电泳 聚丙烯酰胺凝胶，既具有分子筛效应，又具有静电效应，分辨率高于琼聚丙烯酰胺凝胶，既具有分子筛效应，又具有静电效应，分辨率高于琼脂糖凝胶，可达一个核苷酸。同时又可用于蛋白质的分离。脂糖凝胶，可达一个核苷酸。同时又可用于蛋白质的分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，需要自聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，需要自由基催化完成。由基催化完成。常用的催化方法有化学聚合和光聚合：常用的催化方法有化学聚合和光聚合：化学聚合需加入催化剂过硫酸铵化学聚合需加入催化剂过硫酸铵(AP）和加速剂四甲基乙二胺（）和加速剂四甲基

27、乙二胺（TEMED)。光聚合是核黄素在光照射下及有微量氧存在时产生自由基使凝胶聚合。光聚合是核黄素在光照射下及有微量氧存在时产生自由基使凝胶聚合。聚丙烯酰胺凝胶制备在玻璃板上或玻璃管中。聚丙烯酰胺凝胶制备在玻璃板上或玻璃管中。电泳漕分上漕和下漕，各装有电极，通过凝胶使它们连成导电的整体。电泳漕分上漕和下漕，各装有电极，通过凝胶使它们连成导电的整体。电泳中带有电荷的分子在电场作用下移动，移动速度依赖于电场强度、分电泳中带有电荷的分子在电场作用下移动，移动速度依赖于电场强度、分子净电荷以及分子的大小和形状，同时也与介质的离子强度、黏度和温度子净电荷以及分子的大小和形状，同时也与介质的离子强度、黏度

28、和温度有关。有关。四四 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 常规琼脂糖凝胶电泳中，在一定的分子量范围内常规琼脂糖凝胶电泳中，在一定的分子量范围内DNA片段泳动速率与分片段泳动速率与分子量大小呈线性关系，但当子量大小呈线性关系，但当DNA分子大小超过凝胶孔径，分子大小超过凝胶孔径，DNA分子将由无分子将由无规则卷曲的构象沿电场方向伸直，变成与电场平行以通过凝胶空隙，这样规则卷曲的构象沿电场方向伸直，变成与电场平行以通过凝胶空隙，这样大分子通过凝胶的速率无差别，因此无法区分。大分子通过凝胶的速率无差别，因此无法区分。脉冲电场电泳是一种交替变换电场方向的电泳，以一定的角度并以一定脉冲电场电泳是一种交替变换

29、电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场的方向，使的时间变换电场的方向，使DNA在微观上按在微观上按“Z”形向前泳动，从而区分不形向前泳动，从而区分不同大小的同大小的DNA分子。分子。脉冲场电泳可区分脉冲场电泳可区分50kb或或100kb以上的大片段以上的大片段DNA分子。分子。五五 凝胶电泳中凝胶电泳中DNADNA的检测的检测凝胶中凝胶中DNA的检测方法主要有三种：的检测方法主要有三种：1.EB染色，然后在紫外灯下观察，主要用于琼脂糖凝胶；染色，然后在紫外灯下观察，主要用于琼脂糖凝胶；2.银染显色法，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染显色法，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳；3.放射性同位素标记发

30、，放射性同位素标记发，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。第三节第三节 核酸和蛋白质的分子杂交核酸和蛋白质的分子杂交 核酸分子杂交原理：核酸分子杂交原理：双链双链DNA或具有二级结构的或具有二级结构的RNA变性后，其具变性后，其具有互补序列的两条单链的退火或复性过程。有互补序列的两条单链的退火或复性过程。形成的分子有形成的分子有DNA/DNA,DNA/RNA杂合分子形式。杂合分子形式。一一 探针的标记探针的标记 探针：探针：是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列，这些序列使用前需要标记。或寡核苷酸序列，这些序

31、列使用前需要标记。标记：标记：同位素标记，同位素标记，生物素、地高辛或辣根过氧化物酶等标记生物素、地高辛或辣根过氧化物酶等标记（一）探针的制备（一）探针的制备（1）切口平移法标记）切口平移法标记通过复制合成新探针分子，在复制过程中掺入标记核苷酸通过复制合成新探针分子，在复制过程中掺入标记核苷酸,从而使整个从而使整个分子被均匀标记。分子被均匀标记。特点：均匀标记，探针信号强。特点：均匀标记，探针信号强。1.均匀标记均匀标记（2）随机引物法）随机引物法（3）PCR扩增标记扩增标记 利用利用6个核苷酸的随机引物在个核苷酸的随机引物在Klenow酶的作用下，对待检测的酶的作用下，对待检测的DNA进行进

32、行随机扩增，在扩增产物中加入随机扩增，在扩增产物中加入32pdATP，扩增产物用作探针，扩增产物用作探针 在在PCR扩增时加入标记的扩增时加入标记的dNTP，可获得大量探针。，可获得大量探针。2.末端标记末端标记 直接将探针分子的某个原子替换成放射性同位素原子，或直接在探针分直接将探针分子的某个原子替换成放射性同位素原子，或直接在探针分子加上标记的原子或复合物。这种标记一般在探针分子的末端进行，故称子加上标记的原子或复合物。这种标记一般在探针分子的末端进行，故称为末端标记。为末端标记。（1）DNA片段的末端标记片段的末端标记 a.黏末端的补平反应或平末端的置换反应引入标记的核苷酸；黏末端的补平

33、反应或平末端的置换反应引入标记的核苷酸；b.T4多核苷酸激酶在多核苷酸激酶在DNA的的5末端引入标记的磷酸基团；末端引入标记的磷酸基团；c.末端转移酶在末端转移酶在DNA的的3末端连接标记的核苷酸。末端连接标记的核苷酸。（2）.寡核苷酸的标记寡核苷酸的标记 用用DNA聚合酶，以合成的更短的寡核苷酸作引物，或合成两个部分互补的聚合酶，以合成的更短的寡核苷酸作引物，或合成两个部分互补的寡核苷酸使之互为模板，在寡核苷酸使之互为模板，在DNA合成的过程中引入标记的寡核苷酸。合成的过程中引入标记的寡核苷酸。（二）标记物及其检测（二）标记物及其检测同位素同位素32P:半衰期为半衰期为14天，放射性粒子穿透

34、能力强；天，放射性粒子穿透能力强；33P：半衰期为：半衰期为25天，但产生的信号较弱。天，但产生的信号较弱。非同位素标记有：非同位素标记有：生物素标记生物素标记，地高辛标记地高辛标记和和辣根过氧化物酶标记辣根过氧化物酶标记等。等。地高辛标记由德国地高辛标记由德国Roche公司开发，将公司开发，将DIG与与dUTP交联，在掺入核苷酸标记反交联，在掺入核苷酸标记反应中引入应中引入DIG-11-dUTP，使，使DNA或或RNA被被DIG标记。杂交后用碱性磷酸酶标记标记。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针的抗地高辛单抗与标记探针DNA中的中的Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷结合

35、，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的沉淀。酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的沉淀。生物素是一种水溶性维生素，可通过丙烯键与嘧啶的生物素是一种水溶性维生素，可通过丙烯键与嘧啶的C5位共价结合，形成位共价结合，形成biotin-11-dUTP，显色原理同，显色原理同DIG。辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP)标记的探针是通过标记的探针是通过HRP与带正电荷的聚乙烯亚胺交联产与带正电荷的聚乙烯亚胺交联产生带正电荷的复合物，再与带负电荷的单链或双链生带正电荷的复合物，再与带负电荷的单链或双链DNA结合形成共价键，产生酶结合形成共价键，产生酶标记探针，酶可使无色底物显色，从而进行检

36、测标记探针，酶可使无色底物显色，从而进行检测。二二 SouthernSouthern杂交杂交Southern杂交示意图杂交示意图三三 NorthernNorthern杂交杂交总总RNA或或mRNA甲醛变性琼脂糖电泳甲醛变性琼脂糖电泳印迹转膜印迹转膜预预杂交杂交杂交（变性探针）杂交（变性探针）洗膜洗膜放射自显影或显色放射自显影或显色四四 菌落或噬菌斑杂交菌落或噬菌斑杂交菌落原位杂交示意图菌落原位杂交示意图五五 WesternWestern杂交杂交PVDF膜膜目的蛋白质目的蛋白质抗目的蛋白的第一抗体抗目的蛋白的第一抗体羊抗家兔羊抗家兔IgG的第二抗体的第二抗体偶联的碱性磷酸酶偶联的碱性磷酸酶磷酸化

37、生色体系磷酸化生色体系显色显色第四节第四节 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术一一 PCR技术原理技术原理PCR(Polymerase Chain Reaction):一种在模板一种在模板DNA、引物和引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合聚合酶的酶促反应。酶的酶促反应。DNA的体外复制的体外复制v高温变性高温变性:92-96 92-96 v低温退火低温退火:37-7237-72 v适温延伸适温延伸:7272 （一）（一）PCR技术的基本过程技术的基本过程5 53 33 35 5变性、退火、延伸变性、退火、延伸循环循环n n次次一一次次循循环环两两

38、次次循循环环变性变性5 53 33 35 5退火退火5 55 53 33 35 53 3延伸延伸5 53 33 35 55 53 3n n次循环后次循环后双链双链DNADNA在在理论上的最高值为理论上的最高值为2 2n n（二）（二）平台期与平台效应平台期与平台效应平台效应形成与下列因素有关：平台效应形成与下列因素有关：平台效应：平台效应：PCR反应经过一定数量的循环后，随着产物的指数积累趋反应经过一定数量的循环后，随着产物的指数积累趋于饱和，于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进人线性增长或静止期。片段不再呈指数积累，而是进人线性增长或静止期。（1）引物、）引物、dNTP快速掺入底物中，其

39、浓度降低，掺入速度减慢；快速掺入底物中，其浓度降低，掺入速度减慢；（2）随产物增加，酶与模板的比例下降；）随产物增加，酶与模板的比例下降；（3）非特异性产物或引物二聚体与反应物竞争；）非特异性产物或引物二聚体与反应物竞争；（4）产物的再结合。）产物的再结合。PCR产物的积累规律示意图产物的积累规律示意图二二 PCR反应体系反应体系PCR反应需用一定的条件才能完成，这些条件主要指：反应需用一定的条件才能完成，这些条件主要指：v1010 缓冲液（缓冲液（MgMg2+2+）vDNADNA模板模板vdNTP(dATP,dTTP,dGTP,dCTPdNTP(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)v一对

40、引物一对引物vDNADNA聚合酶聚合酶(TaqTaq酶）酶）v无菌水（补足体系用）无菌水（补足体系用）（一）（一）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶v以单链以单链DNADNA为模板，以引物为起点，按为模板，以引物为起点，按5 53 3方方向合成新生互补链向合成新生互补链v无无3 35 5外切酶活性外切酶活性v耐高温（耐高温（95 95 C C）v最适合成最适合成DNADNA温度为温度为72 72 C C（二）引物（二）引物v引物长度引物长度(16-30bp)(16-30bp)退火退火5 55 53 33 35 53 33 35 5变性变性5 53 33 35 5v防止一对引物内及引物之间同源

41、性，避免形成引物的发卡结构或防止一对引物内及引物之间同源性，避免形成引物的发卡结构或“二聚体二聚体”vGCGC含量为含量为40%-60%40%-60%，两引物的，两引物的TmTm值相近，值相近，Tm=2Tm=2（A+TA+T）+4+4（G+CG+C）v引物引物3 3端不能进行修饰或形成二级结构；端不能进行修饰或形成二级结构；v引物的引物的5 5端可进行修饰，如添加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等端可进行修饰，如添加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等 引入突变位点、插入或缺失突变序列等。引入突变位点、插入或缺失突变序列等。（三）（三）PCRPCR反应的最佳条件反应的最佳条件vTaqTaq

42、DNA DNA聚合酶的浓度为聚合酶的浓度为1.0-2.5U/100uL1.0-2.5U/100uL反应液；反应液；vdNTPdNTP的浓度为的浓度为20-200umol/L;20-200umol/L;vMgMg2+2+浓度为浓度为0.5-2.5mmol/L0.5-2.5mmol/L；v引物浓度为引物浓度为0.2-1.0umol/L0.2-1.0umol/L。三三 PCR技术的应用技术的应用（一）（一）反转录反转录PCR（二）（二）锚定锚定PCR（三）（三）反向反向PCR（四）（四）巢式巢式PCR设计一对外测引物和一对内测引物设计一对外测引物和一对内测引物先用外测引物扩增含目的先用外测引物扩增含

43、目的DNA的大片段的大片段再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的DNA片段片段模板模板DNA加外侧引物加外侧引物A和和B引物引物A 引物引物BPCR加内侧引物加内侧引物C和和D引物引物CPCR 引物引物D巢式巢式PCR示意图示意图（五）（五）实时定量实时定量PCR 在普通在普通PCR 仪的基础上再配备一个激发和检测的装置。通过仪的基础上再配备一个激发和检测的装置。通过PCR反反应的数学函数关系，加入标准品，可以对待测样品中的目标基因进行准应的数学函数关系，加入标准品，可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。该法具有高特异性和可靠性，实验结果稳定，重复性

44、好，在临确定量。该法具有高特异性和可靠性，实验结果稳定，重复性好，在临床检测方面有广泛的用途。床检测方面有广泛的用途。（1 1）TaqTaqManMan荧光探针荧光探针TaqTaqManMan荧光探针的标记原理荧光探针的标记原理（2 2）SYBRSYBR荧光探针荧光探针DNA双链非特异性内嵌染料（双链非特异性内嵌染料（SYBR Green）能特异性地结合到双链）能特异性地结合到双链DNA上，而不上，而不结合到单链结合到单链DNA上，并且结合后的染料的发光强度会明显增加，没有结合的染料在溶上，并且结合后的染料的发光强度会明显增加，没有结合的染料在溶液中只能发出很微弱的荧光。液中只能发出很微弱的荧

45、光。第五节第五节 DNADNA序列分析序列分析一一 Maxam-Gilbert化学降解法化学降解法二二 Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法第六节第六节 基因定点诱变基因定点诱变 使已克隆基因或使已克隆基因或DNA片段中的任何一个片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。工程的重要手段。一一 盒式诱变盒式诱变二二 寡核苷酸引物诱变寡核苷酸引物诱变 应用化学合成的应用化学合成的含有突变碱基的寡核含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，苷酸短片段做引物，进行

46、进行DNA复制，使寡复制，使寡核苷酸引物成为新合核苷酸引物成为新合成的成的DNA子链的一个子链的一个部分。部分。三三 PCR诱变诱变重组重组PCRPCR定点突变法示意图定点突变法示意图大大引物诱变法示意图引物诱变法示意图第七节第七节 DNADNA与蛋白质互作分析与蛋白质互作分析一一 酵母杂交系统酵母杂交系统 酵母杂交系统酵母杂交系统酵母单杂交：研究酵母单杂交：研究DNA与蛋白质的相互作用与蛋白质的相互作用酵母双杂交：研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用酵母双杂交：研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用1.酵母双杂交系统的原理酵母双杂交系统的原理 酵母双杂交系统的原理示意图酵母双杂交系统的原理示意图 酵母

47、单杂交系统的原理示意图酵母单杂交系统的原理示意图2.酵母单杂交系统的原理酵母单杂交系统的原理二二 凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的放射性标记的放射性标记的放射性标记的DNADNADNADNA由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质B B B B结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移

48、动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带A AC CB B放射自显放射自显放射自显放射自显影影影影*凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳放射性标记的放射性标记的放射性标记的放射性标记的DNADNADNADNA细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物蛋白质与蛋白质与蛋白质与蛋白质与DNADNA结结结结合合合合*B BDNA-DNA-蛋白质结蛋白质结蛋白质结蛋白质结合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓慢慢慢慢滞后带表明滞后带表明滞后带表明滞后带表明DNADNA与与与与蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合三三 DNaseI足迹试验足迹试验DNaseI足迹试

49、验示意图足迹试验示意图三三 DNA与蛋白质互作的免疫沉淀分析与蛋白质互作的免疫沉淀分析（一）（一）与蛋白质特异结合的与蛋白质特异结合的DNA免疫沉淀分析免疫沉淀分析1).提取目标生物的总提取目标生物的总DNA，酶切，连上接头；，酶切，连上接头；2).将连上接头的将连上接头的DNA与融合蛋白一起温育；与融合蛋白一起温育；3).用融合蛋白上的标签蛋白抗体与融合蛋白结合，用沉淀法分离复合物，用融合蛋白上的标签蛋白抗体与融合蛋白结合，用沉淀法分离复合物，使其结合的使其结合的DNA被免疫共沉淀；被免疫共沉淀；4).用有机溶剂除蛋白，释放用有机溶剂除蛋白，释放DNA（二）（二）染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术原理示意图染色质免疫沉淀技术原理示意图