第二章-食品微生物鉴定技术和方法.ppt

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1、微生物纯培养的获得的方法微生物纯培养的获得的方法稀释涂布法稀释涂布法划线分离法划线分离法利用平皿的生化反应分离法：透明圈法、变色圈利用平皿的生化反应分离法：透明圈法、变色圈法、生长圈法、抑菌圈法法、生长圈法、抑菌圈法“病灶病灶”分离法分离法单细胞或单孢子分离法单细胞或单孢子分离法特殊菌类特殊菌类环保降解菌的分离环保降解菌的分离第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第一节第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法微生物的分离、纯化与接种技术微生物的分离、纯化与接种技术接种和分离工具接种和分离工具 1接种针接种针 2.接种环接种环

2、3.接种钩接种钩 4.5.玻璃涂棒玻璃涂棒 6.接种圈接种圈 7.接种锄接种锄 8.小解剖刀小解剖刀微生物的分离、纯化与接种技术微生物的分离、纯化与接种技术划线接种，分离纯化灼烧灼烧微生物纯培养的获得的方法微生物纯培养的获得的方法无氮培养基无氮培养基筛出固氮菌；筛出固氮菌；无有机碳源的培养基无有机碳源的培养基筛出硝化细菌；筛出硝化细菌；无有机碳源的培养基且无氧有光环境无有机碳源的培养基且无氧有光环境筛出光筛出光合细菌；合细菌；高浓度高浓度NaCl的培养基的培养基筛出耐盐菌株筛出耐盐菌株伊红伊红美蓝的培养基美蓝的培养基筛出大肠杆菌；筛出大肠杆菌；青霉素的培养基青霉素的培养基筛出酵母菌、霉菌；筛出

3、酵母菌、霉菌；第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第一节第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法微生物纯培养的获得的方法微生物纯培养的获得的方法 传统发酵食品的传统发酵食品的starter的确定的确定or 优势菌株的确定优势菌株的确定例如：金华火腿的主要发酵菌；例如：金华火腿的主要发酵菌；优势细菌：乳酸菌、葡萄球菌优势细菌：乳酸菌、葡萄球菌 优势酵母菌：欧诺比假丝酵母、红酵母优势酵母菌：欧诺比假丝酵母、红酵母 微生物生态学方面的菌株确定？微生物生态学方面的菌株确定？非原位检测鉴定、原位检测鉴定非原位检测鉴定、原位检测鉴定第一

4、节第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法检测食品中微生物总数的方法检测食品中微生物总数的方法4种基本方法：（1）标准平板计数或好氧平板计数，适用于活细胞或菌落形成单位。（2）最大可能值法。作为一种统计学的方法来测定活性细胞。（3）染色还原技术。估计拥有还原能力的活性细胞数目。（4）直接显微镜计数法。活性和非活性细胞。常规的标准平板计数（SPC）将一部分食品样品混合或者均质化，在适当的稀释液中进行梯度稀释，然后涂布或者倾注到适宜的琼脂培养基上，在适当的温度下培养一段时间后，使用电子计数器对可见的菌落进行计数。SPC法是目前测定活细胞数和食品产品中菌落

5、形成单位数最广泛的方法。检测食品中微生物总数的方法检测食品中微生物总数的方法常规的标准平板计数（SPC）记录产品中全部活细胞时，要考虑以下因素：1）采用的取样方法2）食品样品中有机体的分类3）食品生物区系的种类4）食品原料的种类5）食品产品的预检历史记录6）所用培养基的营养程度7）所用的培养温度和时间8）pH值、aw和培养基的氧化还原电位9）所用的稀释液类型10）食品样品中有机体的相对数量11）竞争或拮抗有机体的存在检测食品中微生物总数的方法检测食品中微生物总数的方法显微镜菌落计数法 是通过显微镜对载玻片琼脂层上生长的微小菌落计数。首先进行涂布，将0.1ml的牛乳琼脂混合物涂布到4cm2的载玻

6、片上，经培养，干燥和染色，借助显微镜对微小菌落进行计数。另一种方法是将2ml融化的琼脂与2ml热牛乳混合，随后取0.1ml已经接种的琼脂涂抹到4 4cm2的载玻片上，最后用硫堇蓝染色，用16mm物镜的宽视野显微镜观察载玻片。检测食品中微生物总数的方法检测食品中微生物总数的方法最大可能数法 在这种方法中，食品样品的稀释液的准备类似于SPC法。将三个连续等分量样品或稀释梯度的稀释液转移到9个或15个有适宜培养基的试管中，分别称为3试管或5试管法。最初样品中微生物的数量通过查阅标准MPN表来获得。通常MPN法的结果高于SPC的结果。检测食品中微生物总数的方法检测食品中微生物总数的方法MPN法的优点：

7、（1）这种方法相对比较简单（2）与SPC法相比，不同实验室得到的结果更加可靠，相似率较高。（3）特殊微生物群体可以通过适当的选择性培养基进行测定。（4）这是一种测定粪大肠杆菌群含量的方法。缺点：精确度低。检测食品中微生物总数的方法检测食品中微生物总数的方法染色还原试验 在估测相关产品中活菌数量时，通常使用两种染色剂：亚甲基蓝和刃天青。进行染色还原实验时，食品上清液加入任何一种染色剂标准溶液，亚甲蓝会从蓝色还原为白色，而刃天青则从暗蓝色还原为粉红色或白色，染色剂还原的时间与样品中微生物的数量成正比。检测食品中微生物总数的方法检测食品中微生物总数的方法染色还原试验刃天青还原反应快速检测牛肉腐败，被

8、还原为无色、有味、而且结果与SPC法显著相关。乳品中用来估测鲜牛乳的微生物学质量，简单，快捷，经济，而且只有活细胞才对显色剂有明显的还原能力。缺点：微生物对染色剂的还原程度不同，不适用于含还原酶的食品。食品表面微生物的检测1.棉拭/棉拭漂洗法是表面微生物检验中最古老、应用最广泛的方法，它不仅应用于食品及乳制品，而且还用于医院、饭店。方法：将1.5ml液体加到平整的表面上，在3cm2区域内擦拭15s，然后用微升移液管取0.1ml和0.5ml液体，将液体在平板计数琼脂或选择性培养基上涂布或倒平板计数。2.接触平板法 平板直接接触复制微生物法（RODAC）使用一种特殊的皮氏培养皿，平板中倾倒15.5

9、16.5ml培养基，形成琼脂平面；当把平皿倒置时，凝固的琼脂就会与待测表面直接接触，接触后盖上平皿盖、培养，然后进行菌落计数。缺点：仅适用于菌落较分散的表面，对于污染较严重的表面无效。食品表面微生物的检测3.琼脂注射/琼脂肠法琼脂注射法：将1个100ml的注射器去掉针头，改造成中空的柱体，并在中空的部分注入琼脂，通过推动活塞将琼脂从柱体底部挤压到待测表面上，将露在外面的那层切下，置于皮氏平皿中，经过培养后进行菌落计数。琼脂肠法：与注射法类似，只不过用的是塑料试管而不是改造的注射器。广泛用于肉制品或食品加工设备表面微生物的检测。缺点同RODAC法，适合菌落分散和表面污染程度较轻的样品。食品表面微

10、生物的检测其他检测方法：1）直接表面检测法2）粘性薄膜法3）棉拭/琼脂斜面4）超声波装置5）喷雾枪法食品表面微生物的检测第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第一节第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法 微生物传统的鉴定方法微生物传统的鉴定方法 细菌：伯杰氏鉴定细菌学手册（第八版伯杰氏鉴定细菌学手册（第八版1974、第、第九版九版1994）、伯杰氏系统细菌学手册（第一版）、伯杰氏系统细菌学手册（第一版）19841989，2000年分五卷出版。年分五卷出版。放线菌放线菌：中国科学院微生物研究所编著的放线菌：中国科学院微生物研究

11、所编著的放线菌目分科、分属检索表目分科、分属检索表真菌：真菌：Smith、Alexopoulos(阿历克索鲍罗斯阿历克索鲍罗斯）、Ainsworth（安斯沃思）的分类系统（安斯沃思）的分类系统第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第一节第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法伯杰氏手册沿革：伯杰氏手册沿革：伯杰氏手册自从伯杰氏手册自从1923年出版第年出版第1版，直至版，直至1974年第年第8版，均使用版，均使用伯杰氏鉴定细菌学手册伯杰氏鉴定细菌学手册(Bergeys Manual of Determinative Bacte

12、riology)。1984年开始至年开始至1989年分四卷出版，并改名为年分四卷出版，并改名为伯杰氏系统细菌伯杰氏系统细菌学手册学手册(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology)(第一第一版版)1994年又将年又将系统手册系统手册1-4卷中有关属以上分类单元的分类鉴定卷中有关属以上分类单元的分类鉴定资料进行少量的修改补充后汇集成一册仍用原来书名出版，故称资料进行少量的修改补充后汇集成一册仍用原来书名出版，故称之为之为伯杰氏鉴定细菌学手册伯杰氏鉴定细菌学手册第九版第九版第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第一节第一节 食品微生物

13、纯培养的获得和传统的鉴定方法食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法第九版第九版伯杰氏细菌学手册伯杰氏细菌学手册简介：简介：内容分四卷：内容分四卷：第第1卷：一般医学和工业方面重要的革兰氏阴性细卷：一般医学和工业方面重要的革兰氏阴性细菌。菌。第第2卷卷：放线菌以外的革兰氏阳性细菌。：放线菌以外的革兰氏阳性细菌。第第3卷：古细菌、蓝细菌及其他革兰氏阴性细菌。卷：古细菌、蓝细菌及其他革兰氏阴性细菌。第第4卷卷:放线菌。放线菌。第一节第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法新的分类方法新的分类方法:数值分类、核酸在细菌分类数值分类、核酸在细菌分类中的应用、遗

14、传学方法、血清学和化学分类中的应用、遗传学方法、血清学和化学分类等。等。鉴定方法的革新。新版在表型特征基础上，鉴定方法的革新。新版在表型特征基础上，以以DNA资料对属、种的分类地位给予决定性资料对属、种的分类地位给予决定性的判断。将的判断。将DNA中中G+C mol含量的测定、含量的测定、DNA杂交、杂交、RNA寡核苷酸的顺序分析、细胞寡核苷酸的顺序分析、细胞化学分析、数值分类等方法应用到细菌的分化学分析、数值分类等方法应用到细菌的分类学上类学上。第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第一节第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定

15、方法应用原则应用原则查阅相关尽可能的资料查阅相关尽可能的资料每一步利用常识、结果判定每一步利用常识、结果判定最少的试验，最好的结果最少的试验，最好的结果第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第一节第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法鉴定步骤鉴定步骤菌株的纯化菌株的纯化化能自养菌、光合菌化能自养菌、光合菌oror化能异养菌的确定化能异养菌的确定根据分离的过程确定根据分离的过程确定 形态、形态、GramGram、SporeSpore的确定的确定 色素等专一特性色素等专一特性 碳源的类型、氧化性、发酵性碳源的类型、氧化性、发酵性

16、 归属；由属的特征选择试验；进一步确定归属；由属的特征选择试验；进一步确定第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第一节第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法应用实例（应用实例（a-淀粉酶抑制剂产生菌的分离、鉴定、保存）淀粉酶抑制剂产生菌的分离、鉴定、保存）第一步：菌落纯菌株的获得第一步：菌落纯菌株的获得第二步：设计一系列的检测反应第二步：设计一系列的检测反应第三步：对照结果定名第三步：对照结果定名第四步：保存第四步：保存 生化反应平板筛选：生化反应平板筛选：“抑制圈和显色圈法抑制圈和显色圈法”。第二章第二章 食品微生物鉴定技

17、术和方法食品微生物鉴定技术和方法1.DNA同源性和同源性和DNA中（中（G+C）摩尔分数）摩尔分数（G+C)%=（G+C)/(A+T+C+G)%Tm法（热变温度法）测定法（热变温度法）测定菌株间相差菌株间相差2.54.0；种间相差；种间相差510以以上；属间相差上；属间相差10以上以上第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法 每个生物种都有特定的GC%范围，因此 可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25-75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌测定主要用于对表型特征难区分的细菌 作出鉴定，并可检验表型特征分类的合

18、理性，作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。从分子水平上判断物种的亲缘关系。G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的含量的比较主要用于分类鉴定中的否定否定 但具有相似但具有相似G+C含量的生物并不一定表明含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。它们之间具有近的亲缘关系。同一个种内的不同菌株同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在含量差别应在45%以下；同属不同种的差别应低于以下；同属不同种的差别应低于1015%；G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要项基本特征，它对于种

19、、属甚至科的分类鉴定有重要意义。意义。若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其菌株，如果其G+C含量的差别大于含量的差别大于5%，则肯定不是，则肯定不是同一个种，大于同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。则肯定不是同一个属。第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法1.DNA同源性同源性Southern blotting（DNA-DNA)Northern blotting (DNA-RNA)Western blotting(Pro-Anti)Eastern

20、 blotting 第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法2.23S、16S、5S rRNA序列相似性序列相似性核糖体 70S30S 50S16S 21 34 23S+5S蛋白质 第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法16S亚基保守性高，是细菌进化的计时器亚基保守性高，是细菌进化的计时器 普遍存在普遍存在细胞细胞RNA含量较高含量较高rRNA稳定稳定16sRNA序列保守序列保守16sRNA分子量适中分子量适中16S

21、rRNA基因约含有基因约含有1540个核苷个核苷酸，分可变区和保守区，不同微酸，分可变区和保守区，不同微生物可变区核苷酸序列不同，从生物可变区核苷酸序列不同，从而可以利用这些特异性序列进行而可以利用这些特异性序列进行微生物的鉴定；微生物的鉴定；3/8/202335 细细 菌菌 域域 Domain bacteria 古（生）菌古（生）菌 域域 Domain archaea 真真 核核 生生 物物 域域 Domain eukary ota 紫色细菌紫色细菌 线粒体线粒体 甲烷球菌属甲烷球菌属 甲烷杆菌属甲烷杆菌属 真菌真菌 植物植物 叶绿体叶绿体 革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌 甲烷八叠球菌属甲烷八

22、叠球菌属 极端嗜盐菌极端嗜盐菌 动物动物 蓝细菌蓝细菌 无硫绿细菌无硫绿细菌 热球菌属热球菌属 伪变形虫伪变形虫 纤毛虫纤毛虫 黄杆菌黄杆菌 栖热胞菌属栖热胞菌属 热网菌属热网菌属 热变形细菌热变形细菌 粘菌粘菌 鞭毛虫鞭毛虫 产液菌属产液菌属 微孢子微孢子 毛滴虫毛滴虫 双滴虫（假滴虫属）双滴虫（假滴虫属）-生物总系统发育树（根据16S rRNA 序列比较绘制，引自布氏微生物学 2000）第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法具体测定方法：具体测定方法：采用采用RNase T1酶可以将酶可以将16S r

23、RNA酶解酶解在在G位点上切割，得到位点上切割，得到620个碱基大小的序列个碱基大小的序列对这些对这些620碱基片段进行分离、测序碱基片段进行分离、测序比较不同微生物之间比较不同微生物之间SAB（Dice型相关系数）的相型相关系数）的相似性。似性。第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法SAB=2NAB/（NA+NB）NAB代表两菌所含相同寡核苷酸的碱基总数，代表两菌所含相同寡核苷酸的碱基总数，NA和和NB分别代表两菌寡核苷酸所含碱基总数分别代表两菌寡核苷酸所含碱基总数 SAB等于等于1，说明所比较的两菌株

24、，说明所比较的两菌株rRNA序列相序列相同，是同一进化时间的微生物，若同，是同一进化时间的微生物，若SAB值小于值小于 0.1，两菌亲缘关系很远两菌亲缘关系很远 第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法分子生物学技术在细菌鉴定中的应用分子生物学技术在细菌鉴定中的应用核酸探针技术核酸探针技术 核酸扩增技术（核酸扩增技术（PCR技术）技术）基因芯片技术基因芯片技术 3/8/202339 核酸探针技术核酸探针技术原理：两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列，就能够特异性的结合而成为分子杂交链。据此，将己知核苷

25、酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入己变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的。这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链叫DNADNA分子核酸探针或基因探针。分子核酸探针或基因探针。制备核酸探针要注意两个关键性的问题两个关键性的问题：1.要选择特异性强而又无交叉反应的核酸(DNA或RNA)片段，可通过核酸重组和克隆以及人工合成、PCR扩增等技术获得 2.标记物，当前常用同位素(32P、35S等）、光生物素及地高辛(digoxigenin)标记。核酸探针技术核酸探针技术已被用于检验食品中一些常见的病原菌。如产肠毒

26、素性大肠杆菌、沙门氏菌。3/8/202341 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，又称为无细胞克隆系统，是1985年由Mullis创建的一项DNA体外扩增技术。PCR的全过程由变性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension）三步组成的若干个循环，每步之间通过温度的改变来实现转换。其基本原理是在体外对一特定的双链DNA片段（或称靶DNA)进行高效扩增。首先将靶DNA双链加热变性为单链，然后加入两段人工合成的与靶DNA两端邻近序列互补的寡核苷酸片段作为引物(primer)，即左端引物和右端引物，该对引物与互补的DNA单链碱基

27、互补结合后，在有DNA多聚酶和四种dNTPs底物存在的情况下，引物沿模板DNA链（靶DNA单链）按5 3方向延伸，自动合成新的DNA双链。3/8/202342 PCR技技术术有快速、特异、敏感等特点，因而该技术在食品中致病菌的检测方面具有很大的应用潜力。PCR技术能快速地检出肉食品中的沙门氏菌，检测的敏感性和特异性均为100%，保证了检测的准确性。PCR还可用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。3/8/202343 基基 因因 芯芯 片片（gene chip）又又 称称

28、 DNA微微 阵阵 列列（DNA microarray），是是指指将将许许多多特特定定的的寡寡居居核核苷苷酸酸片片断断或或基基因因片片段段作作为为探探针针，有有规规律律的的排排列列固固定定于于支支持持物物上上形形成成的的DNA分分子子阵阵列列。芯芯片片与与待待测测的的荧荧光光标标记记样样品品的的基基因因按按碱碱基基配配对对原原理理进进行行杂杂交交后后，在在通通过过激激光光共共聚聚焦焦荧荧光光监监测测系系统统等等对对其其表表面面进进行扫描即可获取样品分子的数量和序列信息。行扫描即可获取样品分子的数量和序列信息。由由于于该该技技术术同同时时将将大大量量的的探探针针固固定定于于支支持持物物上上，所所

29、以以可可以以一一次次性性对对大大量量序序列列进进行行检检测测和和基基因因分分析析，解解决决了了传传统统的的核核酸酸印印迹迹杂杂交交（southern blot 和和 northern blot等等）操操作作复复杂杂，操作序列数量少等缺点。操作序列数量少等缺点。基基因因芯芯片片技技术术的的突突出出特特点点在在于于其其高高度度的的并并行行性性、多多样样化化、微型化和自动化，以及灵敏、高效和低成本等优点。微型化和自动化，以及灵敏、高效和低成本等优点。第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法3.寡核苷酸种类寡核苷酸

30、种类4.可溶性蛋白质总量或形态学、生理生化特可溶性蛋白质总量或形态学、生理生化特征的数值分类法征的数值分类法5.细胞壁分析细胞壁分析6.血清反应法血清反应法7.细胞脂肪酸组成分析细胞脂肪酸组成分析第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法1.化学方法化学方法热稳定性核酸酶法（金黄色葡萄球菌（热稳定性核酸酶法（金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）鲎试剂法（鲎试剂法（Limulus amoebocyte lysate（LAL）assay）（适）（适用于用于G-细菌）细菌）ATP 测定法（适用于活细胞）测定法（适用于活细胞）辐射线测定法辐射线测定法荧光或发

31、色测定法荧光或发色测定法第三节第三节 食品微生物快速检测技术食品微生物快速检测技术1.化学方法化学方法1）热稳定性核酸酶法（金黄色葡萄球菌（）热稳定性核酸酶法（金黄色葡萄球菌（S.aureus）通过测定食物中的热稳定性核酸酶可以检测出食物中存在的大通过测定食物中的热稳定性核酸酶可以检测出食物中存在的大量的金黄色葡萄球菌。这是由于其产生热稳定性核酸酶以及凝固量的金黄色葡萄球菌。这是由于其产生热稳定性核酸酶以及凝固酶。酶。研究表明：有研究表明：有0.34单位的热稳定性核酸酶存在时，表明有某种单位的热稳定性核酸酶存在时，表明有某种金黄色葡萄球菌生长，而此时肠毒素的含量还不会导致食物中毒。金黄色葡萄球

32、菌生长，而此时肠毒素的含量还不会导致食物中毒。0.34单位的热稳定性核酸酶单位的热稳定性核酸酶 相当于金黄色葡萄球菌产生相当于金黄色葡萄球菌产生9.5103ug肠毒素。肠毒素。热稳定性核酸酶检测法可以作为指示金黄色葡萄球菌生长的热稳定性核酸酶检测法可以作为指示金黄色葡萄球菌生长的方法。方法。第三节第三节 食品微生物快速检测技术食品微生物快速检测技术1.化学方法化学方法2）鲎试剂法）鲎试剂法鲎试剂法又称鲎变形细胞溶解物实验。革兰氏阴性菌可通鲎试剂法又称鲎变形细胞溶解物实验。革兰氏阴性菌可通过产生的内毒素进行鉴定，内毒素是由菌体外膜裸露的脂过产生的内毒素进行鉴定，内毒素是由菌体外膜裸露的脂多糖和被

33、外膜包围的脂多糖和被外膜包围的脂A构成的。构成的。鲎变形细胞溶解物实验采用来自马蹄蟹血液的血细胞溶菌鲎变形细胞溶解物实验采用来自马蹄蟹血液的血细胞溶菌蛋白。溶菌蛋白是已知的对内毒素最敏感的物质。蛋白。溶菌蛋白是已知的对内毒素最敏感的物质。鲎实验是在少量的溶菌液中加入食物悬液或其他待测样品，鲎实验是在少量的溶菌液中加入食物悬液或其他待测样品，并在并在37培养培养1h。内毒素的存在会导致胞溶物凝胶。内毒素的存在会导致胞溶物凝胶。鲎试剂能检出鲎试剂能检出1.0pg脂多糖。由于大肠杆菌含有脂多糖。由于大肠杆菌含有3.0fg脂多脂多糖，所以能检出糖，所以能检出300个革兰氏阴性菌。个革兰氏阴性菌。鲎试剂

34、法鲎试剂法鲎试剂法首次应用于食品检验是检测碎牛肉中的腐败菌。鲎试剂法首次应用于食品检验是检测碎牛肉中的腐败菌。内毒素的滴定度随着革兰氏阴性细菌数量的增加而增加。内毒素的滴定度随着革兰氏阴性细菌数量的增加而增加。由于冷藏鲜肉的变质通常是由革兰氏阴性菌引起的，所以由于冷藏鲜肉的变质通常是由革兰氏阴性菌引起的，所以鲎试剂法是快速检测革兰氏阴性菌总菌数的好方法。鲎试剂法是快速检测革兰氏阴性菌总菌数的好方法。这种方法适合于评价巴氏杀菌前后乳的大肠菌群卫生质量。这种方法适合于评价巴氏杀菌前后乳的大肠菌群卫生质量。3）ATP法ATP在细胞死亡2h后消失，并且每个细菌细胞中的ATP含量恒定，每个细胞约含有10

35、181017mol，相当于105cfu的细菌含有4 104mol/L ATP。一种最简单的ATP测定法之一是利用萤火虫的虫荧光素荧光素酶系统测定。在ATP存在时，用荧光检测器检测荧光素酶发射的荧光强度。萤火虫荧光素的发光量与添加的ATP量成正比。在106109cfu/g范围内，微生物的ATP含量和细菌数呈线性关系。ATP法已经用于鸡肉、猪肉和牛肉的检测。（cfu/mL指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数）第二章第二章 食品微生物鉴定技术和方法食品微生物鉴定技术和方法第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法4）辐射测定法）辐射测定法 利用培养基中利用培养基中14C标记的

36、代谢物为基础，标记的代谢物为基础，当微生物利用这些物质时，释放当微生物利用这些物质时，释放14CO2并用放并用放射能计数器检测。射能计数器检测。14C标记的葡萄糖。对那些不能利用葡萄标记的葡萄糖。对那些不能利用葡萄糖的微生物，糖的微生物，14C标记的甲酸盐或标记的甲酸盐或14C标记的标记的谷氨酸盐。谷氨酸盐。4）辐射测定法）辐射测定法整个程序如下：向15ml带盖的血清瓶中加入1236ml含标记代谢物的培养基，通过充入适当的气体保持需氧或厌氧条件并培养。培养时测定顶空中的14CO2量，检测到CO2气体的时间与产品中微生物的数量成反比。辐射测定法已经用于冷冻浓缩橘子汁的微生物检测。利用14CO2标

37、记的葡萄糖。研究者在610h内检测出含有4种酵母菌和4种乳酸菌，并且菌体浓度为104的样品。在检测的600份果汁样品中，44份菌数104/ml的样品可在12h内检出，41份样品8h内检出。没有假阴性结果发生。第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法2.免疫学方法免疫学方法血清富集技术血清富集技术（Enrichment Serology；ES）免疫放射分析（免疫放射分析（Radioimmunoassay）酶联免疫技术（酶联免疫技术（ELISA）胶体扩散技术（胶体扩散技术（Gel Diffusion）免疫磁性分离技术（免疫磁性分离技术（Immunomagnetic Sep

38、aration）红血球凝集法（红血球凝集法（Hemagglutination）血清富集技术（）血清富集技术（）检测沙门氏菌分为4步：在非选择性培养基前富集18h在亚硒酸盐半胱氨酸和连四硫酸盐肉汤培养基选择性富集24h在M肉汤培养基68h或24h选择性富集与多价H抗血清50摄氏度凝结2h。第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法3.分子基因方法（分子基因方法（Molecular Genetic Method）核酸（核酸（DNA）探针）探针多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（PCR）LUX基因发光基因发光指纹识别方法指纹识别方法 Phage typing（噬菌体分类）、（噬菌

39、体分类）、AFLP（扩增片段长度多态）、（扩增片段长度多态）、MEE（多位点酶电泳）、（多位点酶电泳）、REA（限制性酶分析）、（限制性酶分析）、RAPD（随机扩增多态性（随机扩增多态性DNA）、）、PFGE（脉冲场凝胶电泳）、（脉冲场凝胶电泳）、RFLP（限制性片段长度多态）、（限制性片段长度多态）、Ribotyping（核糖体分类）、（核糖体分类）、Microarrays（微阵列）。（微阵列）。精品课件精品课件！精品课件精品课件！第二节第二节 食品微生物学的现代鉴定方法食品微生物学的现代鉴定方法4.物理方法物理方法生物传感器生物传感器压电晶体压电晶体(Piezoelectric Crystals（accoustical biosensors）)光纤光纤阻抗（阻抗（Impedance）显微量热法显微量热法流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry）生物系统分析仪（生物系统分析仪（BioSys Instrument）