大规模细胞培养及发酵技术.ppt

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1、大规模细胞培养和微生物发大规模细胞培养和微生物发酵技术酵技术 细胞培养的概述细胞培养的概述动物细胞的特点：动物细胞的特点：v无细胞壁无细胞壁v倍增时间长，生长缓慢倍增时间长，生长缓慢v需氧量少，对搅拌敏感需氧量少，对搅拌敏感v聚集体形成聚集体形成v原代细胞培养原代细胞培养50代即开始退化代即开始退化动物细胞培养的概述动物细胞培养的概述动物细胞培养的定义：动物细胞与动物细胞培养的定义：动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生

2、长并维离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术持结构和功能的一门技术动物细胞培养的概述动物细胞培养的概述生长特性生长特性v贴壁生长型：如人胚肺细胞，贴壁生长型：如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞细胞，巨噬细胞，神经细胞v悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴细胞等细胞等体外培养细胞的基本技术体外培养细胞的基本技术体外培养特点体外培养特点体外培养工具体外培养工具体外培养条件体外培养条件体外细胞生长增殖过程体外细胞生长增殖过程培养方法培养方法大规模培养技术大规模培养技术体外培养的特点体外培养的特点营养条件苛刻营养条件苛刻适应性差，敏感适应性差，敏感培养

3、时间长，易污染培养时间长，易污染体外培养的条件体外培养的条件温度，温度，37pH：7.2-7.4气体：氧，二氧化碳，氮气气体：氧，二氧化碳，氮气营养条件：需要多种氨基酸，维生素，营养条件：需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可由血清提供因子，其中多种成分可由血清提供细胞大规模培养技术细胞大规模培养技术细胞大规模培养的方法细胞大规模培养的方法反应器贴壁培养反应器贴壁培养容易换液，不需特殊的分离细胞和培养液的设备，容易换液，不需特殊的分离细胞和培养液的设备，可采用灌流培养获得高密度，但扩大规模较难，可采用灌流培养获得高密度，

4、但扩大规模较难，适合制备量小，价值高的生物药品。（适合制备量小，价值高的生物药品。（CelliGen PlusTM）微载体培养微载体培养最有前途的动物细胞大规模培养技术，兼有悬浮培最有前途的动物细胞大规模培养技术，兼有悬浮培养和贴壁培养的优点，易于放大。（养和贴壁培养的优点，易于放大。（Cytodex，Cytopore和和Cytoline）无血清悬浮培养无血清悬浮培养用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养技术的一种细胞培养技术动物细胞大规模培养过程中动物细胞大规模培养过程中重要参数重要参数pH溶氧溶氧温度温度谷氨酸谷氨酸/谷氨酰胺

5、谷氨酰胺葡萄糖葡萄糖乳酸乳酸CO2动物细胞大规模培养过程中动物细胞大规模培养过程中重要参数重要参数NH4+K+/Na+Ca+渗透压渗透压细胞密度细胞密度动物细胞大规模培养存在的动物细胞大规模培养存在的问题问题细胞凋亡细胞凋亡细胞在高密度条件下，由于细胞的细胞在高密度条件下，由于细胞的多层生长，存在细胞接触抑制效应，多层生长，存在细胞接触抑制效应，细胞的生长和表达均受到严重影响细胞的生长和表达均受到严重影响动物细胞大规模培养存在的动物细胞大规模培养存在的问题问题细胞凋亡主要是细胞生长的条件较恶劣，细胞凋亡主要是细胞生长的条件较恶劣，包括：包括：1.营养缺乏营养缺乏2.有害代谢产物的积累有害代谢产

6、物的积累3.pH和溶氧控制不当和溶氧控制不当4.机械搅拌剪切力较大机械搅拌剪切力较大5.渗透压渗透压细胞大规模培养的应用细胞大规模培养的应用生产疫苗生产疫苗蛋白质和多肽药物蛋白质和多肽药物基因治疗基因治疗单抗单抗微生物培养技术微生物培养技术概述概述传统：酿酒、抗生素、制醋传统：酿酒、抗生素、制醋基因工程：生产蛋白质药物、疫苗等基因工程：生产蛋白质药物、疫苗等（大肠杆菌、酵母）（大肠杆菌、酵母）一般采用高密度发酵技术一般采用高密度发酵技术微生物培养微生物培养培养过程决定于：培养过程决定于：l菌种菌种l培养条件培养条件 微生物培养过程重要参数：微生物培养过程重要参数：l温度温度lpHl溶氧溶氧l葡

7、萄糖葡萄糖/甘油甘油l乙酸乙酸 乳酸乳酸NH4+磷酸盐磷酸盐乙醇乙醇(酵母酵母)甲醇甲醇(酵母酵母)细胞密度细胞密度微生物高密度培养微生物高密度培养发酵培养基发酵培养基表达基因的调控表达基因的调控宿主菌宿主菌质粒的拷贝数及稳定性质粒的拷贝数及稳定性 高密度培养的关键是发酵的补料控制高密度培养的关键是发酵的补料控制,根据根据重组菌的生长特点及产物的表达方式采重组菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养物质的流加方式取合理的营养物质的流加方式l恒速流加恒速流加l变速流加变速流加l指数流加指数流加 微生物高密度培养乙酸的形成微生物高密度培养乙酸的形成:培养液中葡培养液中葡萄糖的含量超过菌体生长所需

8、量或在缺氧萄糖的含量超过菌体生长所需量或在缺氧的情况下的情况下,便会大量产生乙酸便会大量产生乙酸.减少乙酸的策略减少乙酸的策略:l限制性流加葡萄糖限制性流加葡萄糖l甘油代替葡萄糖甘油代替葡萄糖l降低培养温度降低培养温度 宿主菌宿主菌降低比生长速率降低比生长速率透析培养透析培养细胞培养和微生物发酵中的重要参数了解生物技术的应用了解生物技术的应用pH不同的细胞具有不同最佳不同的细胞具有不同最佳 pH范围范围pH 能影响葡萄糖和谷氨酰胺能影响葡萄糖和谷氨酰胺的代谢，在低的代谢，在低pH条件下，葡条件下，葡萄糖消耗速度慢萄糖消耗速度慢pH能影响细胞的生长和目标能影响细胞的生长和目标产物的量产物的量CO

9、2在细胞培养过程中，在细胞培养过程中，CO2 与碳酸氢盐形成缓冲对，稳定培养与碳酸氢盐形成缓冲对，稳定培养液中的液中的 pHCO2也可用于计算呼吸商，反应细胞活力和代谢旺盛程度也可用于计算呼吸商，反应细胞活力和代谢旺盛程度细胞代谢（呼吸作用）会产生细胞代谢（呼吸作用）会产生CO2(废物废物)CO2 水平增加会抑制细胞生长和细胞活性，从而影响目标水平增加会抑制细胞生长和细胞活性，从而影响目标蛋白的表达，当溶液中蛋白的表达，当溶液中CO2达到达到14-15%时，会严重抑制细时，会严重抑制细胞的生长胞的生长CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-DO(溶氧）葡萄糖等需氧来氧化产生葡萄糖等需氧来氧化

10、产生ATP供细胞的能量供细胞的能量用于测量和跟踪细胞消耗氧用于测量和跟踪细胞消耗氧的速率的速率.溶氧在细胞培养和发酵过程中，在细胞培养和发酵过程中，O2 通常是限制营养成分，是因通常是限制营养成分，是因为它在溶液中低溶解度为它在溶液中低溶解度:通常关心对培养液中通常关心对培养液中%O O2 2,也就是也就是“溶氧溶氧”值值(DO):DO):理论理论DO:80%+/-5%(DO:80%+/-5%(哺乳动物细胞培养哺乳动物细胞培养)90%DO2(90%DO2(细菌培养）细菌培养）O O2 2 也可能通过自由基形成对细胞造成伤害也可能通过自由基形成对细胞造成伤害,在低在低pOpO2 2 水平，细水平

11、，细胞的活性通常越高胞的活性通常越高 (O O2 2 值必须维持在最低的水平值必须维持在最低的水平)然而然而,原代细胞可能在低原代细胞可能在低 O O2 2 条件下繁殖受延迟条件下繁殖受延迟 因而，维持正确的因而，维持正确的O O2 2的平衡，对保证所有细胞正确生长都的平衡，对保证所有细胞正确生长都非常重要非常重要,一般一般30-50%30-50%葡萄糖葡萄糖两个主要的功能葡萄糖两个主要的功能:细胞的主要的能量物质细胞的主要的能量物质主要的细胞碳源主要的细胞碳源葡萄糖和谷氨酰胺是相互补充的葡萄糖和谷氨酰胺是相互补充的:产生其他代谢物产生其他代谢物(例如例如:天冬氨酸天冬氨酸)提供能量提供能量在

12、所有细胞中通过糖酵解途径转变在所有细胞中通过糖酵解途径转变成丙酮成丙酮.葡萄糖的代谢随细胞生长而增加葡萄糖的代谢随细胞生长而增加.葡萄糖通常是细胞生长的限制因素葡萄糖通常是细胞生长的限制因素葡萄糖监控细胞反应器和发酵罐中的葡萄糖水平监控细胞反应器和发酵罐中的葡萄糖水平:保证细胞正常生长所需能量保证细胞正常生长所需能量.开发延长细胞培养周期的标准补料策略开发延长细胞培养周期的标准补料策略.计算葡萄糖消耗速率和决定批次培养最佳的起始浓度计算葡萄糖消耗速率和决定批次培养最佳的起始浓度.乳酸=氧化问题在培养过程中，大多数乳酸来自于在培养过程中，大多数乳酸来自于葡萄糖代谢，但也有一部分来自于葡萄糖代谢，

13、但也有一部分来自于谷氨酰胺代谢谷氨酰胺代谢.基于高细胞密度和深液位，氧的基于高细胞密度和深液位，氧的消耗非常大消耗非常大.典型的范围典型的范围(组织培养组织培养):0-):0-5 5 g/Lg/LO O2 2 消耗导致乳酸的形成，最终导致消耗导致乳酸的形成，最终导致pHpH的下降的下降.对恒定的对恒定的 pH:pH:抑制细胞生长的乳抑制细胞生长的乳酸水平在低到酸水平在低到 4 mM 4 mM 到高达到高达 70 70 mM(mM(取决于细胞取决于细胞).).在大多数情况下，铵对细胞生长的在大多数情况下，铵对细胞生长的抑制比乳酸更严重抑制比乳酸更严重.乳酸监控长时间细胞培养中乳酸的积累监控长时间

14、细胞培养中乳酸的积累.计算乳酸产量与葡萄糖的消耗之间的代谢关系计算乳酸产量与葡萄糖的消耗之间的代谢关系考察乳酸盐对细胞表达产物的毒害影响考察乳酸盐对细胞表达产物的毒害影响铵细胞培养和发酵中铵的来源细胞培养和发酵中铵的来源:主要来源主要来源:代谢谷氨酰胺代谢谷氨酰胺(谷氨酰胺谷氨酰胺降解降解)谷氨酰胺降解成铵和吡咯烷酮酸谷氨酰胺降解成铵和吡咯烷酮酸其他氨基酸的脱氨基作用其他氨基酸的脱氨基作用铵的水平也取决于细胞密度和细胞代谢铵的水平也取决于细胞密度和细胞代谢方式方式.引起细胞抑制的铵离子浓度范围引起细胞抑制的铵离子浓度范围:从从:0.5 mM(L Mouse Cells)到到:40.0 mM(M

15、.Ascites Tumor Cells)(不同的细胞株对铵有不同的耐受度不同的细胞株对铵有不同的耐受度)铵pH 会受会受 NH3增加的影响增加的影响:NH4+NH3+H+铵的增加也会改变细胞内蛋白质的运动铵的增加也会改变细胞内蛋白质的运动.监控发监控发酵罐和生物反应器中铵的水平（废物）酵罐和生物反应器中铵的水平（废物）.推算谷胺酰胺的降解水平推算谷胺酰胺的降解水平.考察铵浓度对细胞密度和产物浓度的影响考察铵浓度对细胞密度和产物浓度的影响.监控引入培养基的质量监控引入培养基的质量.限制铵抑制的策略增加换液的速率增加换液的速率(补料补料).).维持培养液中低的谷氨酰铵浓度减少其转化和降解维持培养

16、液中低的谷氨酰铵浓度减少其转化和降解.在低的在低的 pH pH培养减少培养减少NHNH3 3形成形成.去除培养液中的铵去除培养液中的铵:酶转化酶转化通过特殊的通过特殊的 “PTFEPTFE”膜将膜将 NHNH3 3 扩散到低扩散到低pH pH 溶液中溶液中使用能够逐步接受高使用能够逐步接受高 NH NH3 3 浓度的细胞浓度的细胞谷氨酰胺与葡萄糖一样与葡萄糖一样,谷氨酰胺也是细胞的主要物质谷氨酰胺也是细胞的主要物质:*碳和氮碳和氮*能量能量谷氨酰胺通常被认为是细胞培养的主要限制营养谷氨酰胺通常被认为是细胞培养的主要限制营养谷氨酰胺是生物合成的前体物质谷氨酰胺是生物合成的前体物质:*嘌呤嘌呤*嘌

17、呤核苷嘌呤核苷谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受体谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受体谷氨酰胺监控谷氨酰胺的水平监控谷氨酰胺的水平:确保细胞生长所需的能量确保细胞生长所需的能量.开发长时间细胞培养标准化补料策略开发长时间细胞培养标准化补料策略.计算谷氨酰胺的消耗速率和决定批次培养最佳的其始计算谷氨酰胺的消耗速率和决定批次培养最佳的其始浓度浓度.谷氨酸需用来计算谷氨酰胺需用来计算谷氨酰胺需确证谷氨酸需确证谷氨酸 的浓度，确保没加进谷氨酰的浓度，确保没加进谷氨酰胺结果胺结果.谷氨酰胺的降解产物谷氨酰胺的降解产物Na/KNa-K:对合适培养基生产很重要对合适培养基生产很重要.维持

18、溶液维持溶液/培养基合适的离子强度培养基合适的离子强度.渗透压渗透压是溶液浓度的一个反应渗透压是溶液浓度的一个反应:测定渗透压的参考方法是使用渗透压计测定渗透压的参考方法是使用渗透压计典型细胞培养液渗透压值典型细胞培养液渗透压值:300+/-30 mOsmol/kg.300+/-30 mOsmol/kg.渗透压升高渗透压升高 50-100 mOsmol/kg 50-100 mOsmol/kg 会明显影响某些细胞的生会明显影响某些细胞的生长长.某些溶液某些溶液/化合物可作为渗透压的保护剂化合物可作为渗透压的保护剂(维持渗透压稳维持渗透压稳定和更低定和更低).).这些物质这些物质:甘氨酸，肌氨酸，

19、脯氨酸甘氨酸，肌氨酸，脯氨酸渗透压渗透压用于对引进的培养基进行质量控制用于对引进的培养基进行质量控制关联渗透压与细胞数、细胞活性和产量的关系关联渗透压与细胞数、细胞活性和产量的关系监控连续补加营养引起渗透压的增加监控连续补加营养引起渗透压的增加细胞密度细胞密度通常等于细胞密度通常等于“生物量生物量”它是指给定体积的细胞数，可以是体积浓度或百分比它是指给定体积的细胞数，可以是体积浓度或百分比浓度浓度.它不是指活细胞数量它不是指活细胞数量(但可很好显示细胞活力）但可很好显示细胞活力）细胞活力细胞活力/活性测定取决于细胞的种类、细胞生命周期及膜活性测定取决于细胞的种类、细胞生命周期及膜的结构的结构.“活性取决于你怎样定义细胞活性取决于你怎样定义细胞.”细胞密度细胞密度不意味着终产物量或生产率细胞密度不意味着终产物量或生产率它显示它显示 细胞体积细胞体积/数量数量,但不能体现但不能体现:是否细胞是正确细胞是否细胞是正确细胞.是否终产物是由细胞产生是否终产物是由细胞产生.是否所有的细胞是活的是否所有的细胞是活的.在细胞中的终产物的量在细胞中的终产物的量.