第七章生物信息学与生物芯片技术...ppt

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1、第七章第七章生物信息学生物信息学与生物芯片与生物芯片 1主要内容主要内容7.1 基因芯片原理与应用基因芯片原理与应用7.2 蛋白质芯片原理与应用蛋白质芯片原理与应用2生物芯片技术生物芯片技术是是2020世纪世纪9090年代中期以来影响年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融最深远的重大科技进展之一，是融微电子学微电子学、生物学生物学、物理学物理学、化学化学、计算机科学计算机科学为一体为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。价值，又具有明显的产业化前景。3 1995年秋天，在斯坦福大学做博士后的年秋天，在斯坦福大学做博

2、士后的Mark Schena(M.谢纳）等人在谢纳）等人在Science杂志上发表论文，杂志上发表论文，第一次成功地应用了基因芯片技术对拟南芥的基因第一次成功地应用了基因芯片技术对拟南芥的基因表达进行了分析。标志着基因芯片进入了广泛应用表达进行了分析。标志着基因芯片进入了广泛应用的新阶段。的新阶段。Mark Schena,Dari Shalon,Ronald W.Davis,and Patrick O.Brown.Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.Sci

3、ence,1995:467-470.4生物芯片生物芯片:是将生物分子是将生物分子(寡聚核苷酸、寡聚核苷酸、cDNA、基因组基因组DNA、多肽、抗原、抗体等多肽、抗原、抗体等)固定于硅片、固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵。成的生物分子点阵。生物芯片技术生物芯片技术是生命科学研究中继是生命科学研究中继基因克隆基因克隆技术、基因自动测序技术、技术、基因自动测序技术、PCR 技术技术后的又后的又一次革命性技术突破。一次革命性技术突破。5生物芯片生物芯片基因芯片基因芯片蛋白质芯片蛋白质芯片生物芯片的特点：生物芯片的特点：1

4、1）高度集成）高度集成2 2）微型化）微型化3 3）自动化）自动化4 4）快速）快速67.1 基因芯片原理与应用基因芯片原理与应用7一、基因芯片基本原理一、基因芯片基本原理基因芯片（基因芯片（gene chipgene chip），又称），又称DNADNA微阵列微阵列（microarraymicroarray），是由大量），是由大量DNADNA或寡核苷酸探针或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理其工作的基本原理是通过杂交检测信息是通过杂交检测信息。基因芯片把大量已知序列探针集成在同一个基片基因芯片把大量已知序列探针集成在同一个基片上，经过标记的若干靶

5、核酸序列通过与芯片特定上，经过标记的若干靶核酸序列通过与芯片特定位置上的探针杂交位置上的探针杂交,便可根据碱基互补匹配的原便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。理确定靶基因的序列。8DNADNA微阵列（微阵列（microarraymicroarray）910AffymetrixAffymetrix公司（昂飞）公司（昂飞）由美国著名科学家斯蒂文由美国著名科学家斯蒂文 弗尔多博弗尔多博士士(Stephen Fodor)(Stephen Fodor)在在19921992年创办年创办,总部位于美国加利福尼亚州总部位于美国加利福尼亚州硅谷。公司于硅谷。公司于19961996年在美国纳斯达克年在美国

6、纳斯达克(NASDAQ)(NASDAQ)上市。公司在加上市。公司在加州首府州首府SacramentoSacramento、EmeryvilleEmeryville、波士顿、英国伦敦、日本东、波士顿、英国伦敦、日本东京、新加坡都设有分部。京、新加坡都设有分部。昂飞是生物芯片产业的先驱，公司长期与美国国立卫生研究院、昂飞是生物芯片产业的先驱，公司长期与美国国立卫生研究院、斯坦福大学、麻省理工、哈佛、耶鲁、加州大学伯克利等世界斯坦福大学、麻省理工、哈佛、耶鲁、加州大学伯克利等世界知名院校和研究所合作知名院校和研究所合作,在生物芯片行业中始终处于国际领先在生物芯片行业中始终处于国际领先地位。地位。美国

7、昂飞公司美国昂飞公司http:/ http:/ http:/ 25 mermer左右，一般通过在片左右，一般通过在片（原位）合成方法得到，（原位）合成方法得到，这类芯片既可用于这类芯片既可用于mRNAmRNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析的表达监控，也可以用于核酸序列分析。17根据探针标记方法，基因芯片也可分为两类根据探针标记方法，基因芯片也可分为两类1 1）同位素标记探针）同位素标记探针 32P、33P2 2）非同位素标记探针）非同位素标记探针 生物素、地高辛生物素、地高辛18一是在片合成法一是在片合成法在片合成法是基于组合化学的合成原理。在在片合成法是基于组合化学的合成原理。在片合成法

8、制备片合成法制备DNADNA芯片的关键是高空间分辨率的模芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。另一种方法是点样法另一种方法是点样法首先首先按常规方法制备按常规方法制备cDNAcDNA（或寡核苷酸）探（或寡核苷酸）探针库，针库，然后然后通过特殊的针头或微喷头通过特殊的针头或微喷头,分别把不分别把不同的探针溶液，逐点分配在固相基底表面上的不同的探针溶液，逐点分配在固相基底表面上的不同位点同位点,并通过物理或化学的结合使探针被固定于并通过物理或化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。芯片的相应位点。（二）基因芯片的制备（主要有两种

9、基本方法（二）基因芯片的制备（主要有两种基本方法）19（三）样品制备及芯片杂交（三）样品制备及芯片杂交 根据基因芯片的检测目的不同根据基因芯片的检测目的不同,可以把样品制备可以把样品制备方法分为：方法分为：1 1）用于表达谱测量的）用于表达谱测量的mRNAmRNA样品制备样品制备 2 2）用于多态性）用于多态性(或突变或突变)研究的基因样品的制备研究的基因样品的制备20杂交：杂交：检测过程平行化，可以同时检测成百上千的检测过程平行化，可以同时检测成百上千的基因序列，而且由于集成的显微化，使得杂交所基因序列，而且由于集成的显微化，使得杂交所需的探针及待检测样品均大为减少，杂交时间明需的探针及待检

10、测样品均大为减少，杂交时间明显缩短，一般的分子杂交过程可在显缩短，一般的分子杂交过程可在3030分钟内完成。分钟内完成。常规：常规：1 1）杂交时间长）杂交时间长4-244-24h h2 2）样品处理数量少（样品处理数量少（1-1-几个）几个）21（四）杂交信号检测四）杂交信号检测对于用荧光素标记经扩增（也可用其他放大技术）对于用荧光素标记经扩增（也可用其他放大技术）的序列或样品，与芯片上的探针进行杂交，然后的序列或样品，与芯片上的探针进行杂交，然后冲洗，采集冲洗，采集荧光图像荧光图像。图像的采集用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、图像的采集用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、激光扫描仪激光扫描仪、半

11、导体传感器半导体传感器等进行。等进行。22三、生物信息学在基因芯片中的应用三、生物信息学在基因芯片中的应用生物信息学在基因芯片中的应用主要体现在三生物信息学在基因芯片中的应用主要体现在三个方面个方面:确定芯片检测目标确定芯片检测目标芯片设计芯片设计实验数据管理与分析实验数据管理与分析23（一）药物筛选和新药开发（一）药物筛选和新药开发由于所有药物（或兽药）都是直接或间接地通过修饰、由于所有药物（或兽药）都是直接或间接地通过修饰、改变人类（或相关动物）基因的表达及表达产物的功能改变人类（或相关动物）基因的表达及表达产物的功能而生效，而芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分而生效，而芯片技术具有高

12、通量、大规模、平行性地分析基因表达的能力，在药物筛选方面具有巨大的优势。析基因表达的能力，在药物筛选方面具有巨大的优势。用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验甚用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验甚至临床，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。至临床，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。四、基因芯片的应用四、基因芯片的应用24（二）疾病诊断（二）疾病诊断基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简方面：一是

13、高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。便；三是可同时检测多种疾病。采用基因芯片技术，疾病的早期诊断率将大大采用基因芯片技术，疾病的早期诊断率将大大提高，而误诊率会大大降低，同时有利于医生综提高，而误诊率会大大降低，同时有利于医生综合地了解各个系统的疾病状况。合地了解各个系统的疾病状况。25（三）环境保护（三）环境保护在环境保护上，基因芯片也广泛的用途，一方面在环境保护上，基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选动植物的污染和危害，同时也能够通过

14、大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。够治理污染源的基因产品。（四）司法（四）司法如果建立全国甚至全世界的如果建立全国甚至全世界的DNADNA指纹库，可直接在指纹库，可直接在犯犯罪现场罪现场对疑犯留下来的头发、唾液、血液、精液等进行对疑犯留下来的头发、唾液、血液、精液等进行分析，并与分析，并与DNADNA指纹库系统进行比较，以快速、准确地指纹库系统进行比较，以快速、准确地破案。目前，科学家正着手于将生物芯片技术应用于亲破案。目前，科学家正着手于将生物芯片技术应用于亲子鉴定中，应用生物芯片后，鉴定精度将大幅

15、提高。子鉴定中，应用生物芯片后，鉴定精度将大幅提高。26基因芯片技术可以用来筛选农作物的基因基因芯片技术可以用来筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因，也可以用于基因扫描及基因文冻的相关基因，也可以用于基因扫描及基因文库作图、商品检验检疫等领域。目前该类市场库作图、商品检验检疫等领域。目前该类市场尚待开发。尚待开发。（五）现代农业（五）现代农业27（六）研究领域（六）研究领域一组寡核苷酸探针TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTA

16、GATC杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATCATACGTTA1 1测定未知序列测定未知序列282 2DNADNA序列突变检测分析序列突变检测分析有两种方法可以进行已知突变点的分析有两种方法可以进行已知突变点的分析:一种方法是对于目标序列上已知的突变点，以该点为中心，从一种方法是对于目标序列上已知的突变点，以该点为中心，从目标序列选取一个片段，作为设计探针的参考序列。根据参考目标序列选取一个片段，作为设计探针的参考序列。根据参考序列，分别设计四个高度特异的探针，这四个探针除中心位置序列，分别设计四个

17、高度特异的探针，这四个探针除中心位置外均相同并与参考序列互补。外均相同并与参考序列互补。另一种方法是对于目标序列上已知的突变点，分别设计四组探另一种方法是对于目标序列上已知的突变点，分别设计四组探针，其中每一组探针分别检测一种核苷酸替换。同一组中的各针，其中每一组探针分别检测一种核苷酸替换。同一组中的各个探针长度相同，相互之间交叠，并且每个探针均覆盖对应的个探针长度相同，相互之间交叠，并且每个探针均覆盖对应的突变点。突变点。29303 3 SNPSNP分析分析同一物种的不同个体基因组约有同一物种的不同个体基因组约有99.999.9相同，相同，正是正是0.10.1的不同才体现了个体的差异或多样的

18、不同才体现了个体的差异或多样性。性。单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNP)SNP)：是指基因组内特定是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最小一种在群体中的频率不小于小一种在群体中的频率不小于1 1。人人-3-30.10.1序列变化序列变化11-改变蛋白质功能改变蛋白质功能900900个基因产物不同。与生物进化历程、种族关系、疾病个基因产物不同。与生物进化历程、种族关系、疾病发生相关。发生相关。314 4、基因表达分析、基因表达分析基因表达是以基因的基因表达是以基因的DNADNA为模板进行为模板进行mRNAmRNA转录和蛋白质转录和蛋白质翻

19、译合成的过程，各种基因的表达存在差异，一种组翻译合成的过程，各种基因的表达存在差异，一种组织中不同基因表达水平的差异可达织中不同基因表达水平的差异可达1 1万倍万倍。功能基因研。功能基因研究的一种重要的方法就是采用高通量究的一种重要的方法就是采用高通量基因表达检测基因表达检测技技术，全面分析基因的表达水平，了解基因的功能。术，全面分析基因的表达水平，了解基因的功能。32335 5、寻找新基因、寻找新基因 在缺乏任何序列信息的条件下，基因芯片也可用于基因发在缺乏任何序列信息的条件下，基因芯片也可用于基因发现。如现。如HMEHME基因和黑色素瘤生长刺激因子就是通过基因芯片技基因和黑色素瘤生长刺激因

20、子就是通过基因芯片技术发现的。术发现的。目前，大量涌现的人类目前，大量涌现的人类ESTsESTs给给cDNAcDNA微阵列提供了丰富的序微阵列提供了丰富的序列资源，数据库中列资源，数据库中ESTsESTs代表了人类基因，因此代表了人类基因，因此ESTsESTs微阵列可微阵列可在缺乏其它序列信息的条件下用于基因发现和基因表达检测，在缺乏其它序列信息的条件下用于基因发现和基因表达检测，从而加快人类基因组功能分析的进程。从而加快人类基因组功能分析的进程。347.2 蛋白质芯片原理与应用蛋白质芯片原理与应用35蛋白质芯片的提出蛋白质芯片的提出DNA芯片的成功证明了生物芯片是可行的DNADNA芯片对医学

21、与生物学研究产生了巨大影响芯片对医学与生物学研究产生了巨大影响DNADNA芯片成为研究活体基因组的强有力工具芯片成为研究活体基因组的强有力工具DNA芯片不能作为蛋白质检测的直接依据mRNAmRNA与蛋白质表达水平不直接相关与蛋白质表达水平不直接相关蛋白质组计划需要一种新的蛋白质分析技术36 尽管还存在许多问题尽管还存在许多问题,2000,2000年秋天年秋天,SchreiberSchreiber小组展示了他们可以制造高密度小组展示了他们可以制造高密度蛋白质芯片并且保持蛋白质成键能力的技蛋白质芯片并且保持蛋白质成键能力的技术。术。37蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋

22、白质有序地固定于滴定板、滤膜和载蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片玻片等各种载体上成为检测用的芯片；然后然后，用标记了特定荧光抗体的蛋白质用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分与芯片作用或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去；再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术术，测定芯片上各点的荧光强度测定芯片上各点的荧光强度，通过通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系作用的关系，由此达到测定各种蛋白质由此达到测定各种蛋白质

23、功能的目的。功能的目的。一、一、蛋白质蛋白质芯片基本原理芯片基本原理蛋白质固定蛋白质固定（探针）（探针）杂交杂交扫描成像或进扫描成像或进行质谱分析行质谱分析蛋白质功能鉴定蛋白质功能鉴定38391 1）保持蛋白质的活性。）保持蛋白质的活性。2 2）保证蛋白质正确定位。）保证蛋白质正确定位。3 3）与现存的）与现存的mRNAmRNA芯片研究工具要相兼容。芯片研究工具要相兼容。4 4）缺乏与）缺乏与PCRPCR等价的蛋白质扩增技术，因而对等价的蛋白质扩增技术，因而对低丰度蛋白质的检测是蛋白质芯片技术的极大低丰度蛋白质的检测是蛋白质芯片技术的极大挑战。挑战。蛋白质芯片要解决的问题：蛋白质芯片要解决的问

24、题：40蛋白质活性保持蛋白质活性保持在制备芯片过程中在制备芯片过程中,为了保证被固定在载体上为了保证被固定在载体上的蛋白质依然保持天然的构象和生物学活性的蛋白质依然保持天然的构象和生物学活性,他们他们在蛋白质点样的磷酸缓冲液（在蛋白质点样的磷酸缓冲液（PBS)PBS)中加入中加入40%的甘的甘油油,以防止因液体的蒸发而造成的蛋白质变性。以防止因液体的蒸发而造成的蛋白质变性。41弹性蛋白弹性蛋白模拟物模拟物亮氨酸链亮氨酸链蛋白质固定蛋白质固定化学表面型蛋白质芯化学表面型蛋白质芯片片和和生物表面型蛋白生物表面型蛋白质芯片质芯片。化学表面芯化学表面芯片片又可分为疏水型、又可分为疏水型、亲水型、弱阳离

25、子、亲水型、弱阳离子、强阴离子、金属离子强阴离子、金属离子螯合、特异结合等，螯合、特异结合等，以适用检测不同情况以适用检测不同情况下蛋白表达。下蛋白表达。生物表生物表面芯片面芯片人又可分为抗人又可分为抗原原-抗体、受体抗体、受体-配体、配体、DNADNA蛋白质、酶等蛋白质、酶等芯片。芯片。42二、二、蛋白质蛋白质芯片的应用芯片的应用 蛋白质芯片技术具有快速、并行、自动化和高通蛋白质芯片技术具有快速、并行、自动化和高通量的特点量的特点,它能同时对全基因组水平的上千种不同它能同时对全基因组水平的上千种不同蛋白质进行分析蛋白质进行分析,是蛋白质组研究的重要手段。目是蛋白质组研究的重要手段。目前已经广

26、泛应用于前已经广泛应用于蛋白质表达谱的分析蛋白质表达谱的分析、蛋白质功蛋白质功能能及及蛋白质蛋白质-蛋白质间相互作用的研究、临床疾病蛋白质间相互作用的研究、临床疾病(如肿瘤等如肿瘤等)的诊断和疗效评价、药物新靶点的筛选的诊断和疗效评价、药物新靶点的筛选和新药的研制和新药的研制等各个领域。等各个领域。431 1、蛋白质研究方面的应用、蛋白质研究方面的应用蛋白质芯片技术目前是蛋白质组学研究中最具蛋白质芯片技术目前是蛋白质组学研究中最具有应用前景的一项技术。有应用前景的一项技术。1 1）氨基酸序列测定（与质谱联用）。）氨基酸序列测定（与质谱联用）。2 2）差异表达蛋白的筛选鉴定。）差异表达蛋白的筛选

27、鉴定。442 2 研究蛋白质的相互作用研究蛋白质的相互作用包括蛋白质包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质蛋白质相互作用、蛋白质-RNARNA相互作用、蛋白质相互作用、蛋白质-DNADNA相互作用相互作用453、临床方面的应用临床方面的应用蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用。尤蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用。尤其是在疾病的诊断和疗效判定其是在疾病的诊断和疗效判定,即即生物学标志物生物学标志物的检的检测上测上,蛋白质芯片技术具有很大的应用价值和前景。蛋白质芯片技术具有很大的应用价值和前景。建立疾病的蛋白质表型指纹建立疾病的蛋白质表型指纹(phenomic fingerprint)。利用疾

28、病的表型指纹库利用疾病的表型指纹库,我们便可以对各种我们便可以对各种疾病进行诊断。疾病进行诊断。疾病的蛋白质表型指纹：疾病的蛋白质表型指纹：某一疾病组织与健康组织在蛋白质表达量方面的差异某一疾病组织与健康组织在蛋白质表达量方面的差异。464 4、新药研制方面的应用新药研制方面的应用受体蛋白固定于芯片受体蛋白固定于芯片候选药物荧光标记候选药物荧光标记杂交杂交确定新药确定新药47三、问题和前景三、问题和前景1 1）首先是成本问题）首先是成本问题 2 2）蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的）蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的变化便可能引起最后结果的不同变化便可能引起最后结果的不同,实验条件不易实验条件不易控制控制,使得实验结果的可重复性相对不足。使得实验结果的可重复性相对不足。48考试题型1、名词解释、名词解释2、填空题、填空题3、选择题、选择题4、简答题、简答题5、论述题、论述题注：注：1 1）开卷考试、独立完成！）开卷考试、独立完成！2 2）认真复习、争取优异成绩！）认真复习、争取优异成绩！49