细胞凋亡与免疫.ppt

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1、细胞凋亡细胞凋亡与与免疫免疫1引言引言细胞凋亡是一种普遍存在的生物学过程细胞凋亡是一种普遍存在的生物学过程细胞凋亡是一种普遍存在的生物学过程细胞凋亡是一种普遍存在的生物学过程 ，它与细，它与细，它与细，它与细胞增殖、细胞分化都是最重要的生命现象，正是由胞增殖、细胞分化都是最重要的生命现象，正是由胞增殖、细胞分化都是最重要的生命现象，正是由胞增殖、细胞分化都是最重要的生命现象，正是由于细胞增殖、细胞分化、细胞调亡的相互联系、相于细胞增殖、细胞分化、细胞调亡的相互联系、相于细胞增殖、细胞分化、细胞调亡的相互联系、相于细胞增殖、细胞分化、细胞调亡的相互联系、相互制约的关系，才互制约的关系，才互制约的

2、关系，才互制约的关系，才保证了生物体的正常发育保证了生物体的正常发育保证了生物体的正常发育保证了生物体的正常发育。正常凋亡过程受阻或某种原因所致不正常的细胞正常凋亡过程受阻或某种原因所致不正常的细胞正常凋亡过程受阻或某种原因所致不正常的细胞正常凋亡过程受阻或某种原因所致不正常的细胞凋亡，都会使机体出现病症。因此凋亡，都会使机体出现病症。因此凋亡，都会使机体出现病症。因此凋亡，都会使机体出现病症。因此对细胞凋亡的研对细胞凋亡的研对细胞凋亡的研对细胞凋亡的研究有助于某些疾病的阐明与治疗究有助于某些疾病的阐明与治疗究有助于某些疾病的阐明与治疗究有助于某些疾病的阐明与治疗。细胞凋亡的研究是近年来生命科

3、学中发展起来的细胞凋亡的研究是近年来生命科学中发展起来的细胞凋亡的研究是近年来生命科学中发展起来的细胞凋亡的研究是近年来生命科学中发展起来的热点课题。早期基于热点课题。早期基于热点课题。早期基于热点课题。早期基于形态学和生物化学形态学和生物化学形态学和生物化学形态学和生物化学，近期则是，近期则是，近期则是，近期则是基于基于基于基于分子生物学技术从基因调控、信号转导分子生物学技术从基因调控、信号转导分子生物学技术从基因调控、信号转导分子生物学技术从基因调控、信号转导等方面等方面等方面等方面研究。研究。研究。研究。2主要内容主要内容l细胞凋亡概述（基本概念、意义、生物学特征、调节、信号传递等）l细

4、胞凋亡与免疫生理l细胞凋亡与免疫病理l细胞凋亡的检测方法l细胞凋亡研究相关展望3一细胞凋亡概述一细胞凋亡概述1.1.基本概念及生物学意义基本概念及生物学意义：凋亡（凋亡（凋亡（凋亡（apoptosisapoptosis）一词于一词于19721972年年KerrKerr（英国阿伯丁（英国阿伯丁大学病理学教授）大学病理学教授）引入，是一个希腊语合成词引入，是一个希腊语合成词,原意指原意指花瓣或树叶的自然脱落（花瓣或树叶的自然脱落（ApoApo脱落脱落ptosisptosis飘零飘零=ApoptosisApoptosis）。）。基本概念：基本概念：基本概念：基本概念：细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡

5、是一个是一个是一个是一个“形态学形态学形态学形态学”概念，是对细概念，是对细概念，是对细概念，是对细胞超微结构观察的基础上得出的胞超微结构观察的基础上得出的胞超微结构观察的基础上得出的胞超微结构观察的基础上得出的特指一种由基因控制、特指一种由基因控制、特指一种由基因控制、特指一种由基因控制、形态学特征与坏死截然不同的自主性细胞死亡方式形态学特征与坏死截然不同的自主性细胞死亡方式形态学特征与坏死截然不同的自主性细胞死亡方式形态学特征与坏死截然不同的自主性细胞死亡方式。l1972年，年，Kerr,Wylle和和Curry在许多正常组织在许多正常组织中观察到一种与经典的细胞坏死形态特征不同中观察到一

6、种与经典的细胞坏死形态特征不同的现象：细胞收缩、细胞碎片、散在不完整细的现象：细胞收缩、细胞碎片、散在不完整细胞等，据此，他们首次提出胞等，据此，他们首次提出apoptosis一词。一词。国内常译为细胞凋亡、细胞凋落、细胞凋谢、国内常译为细胞凋亡、细胞凋落、细胞凋谢、细胞衰亡等，细胞衰亡等，多数学者倾向于多数学者倾向于“细胞凋亡细胞凋亡”。强调这一过程是一种自然的生理学过程。强调这一过程是一种自然的生理学过程。u细胞凋亡细胞凋亡与与细胞程序性死亡细胞程序性死亡细胞程序性死亡细胞程序性死亡细胞程序性死亡细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）PCDPCD最初是最初是1

7、9561956年发育生物学中提出的概念，是个功能年发育生物学中提出的概念，是个功能性概念，一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物性概念，一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的预定的，并，并受到严受到严格程序控制的正常组成部分格程序控制的正常组成部分。细胞凋亡和程序性死亡具有非常密切地关系。细胞凋亡和程序性死亡具有非常密切地关系。大多数大多数情况下程序性细胞死亡是以凋亡的方式进行，但并不是所情况下程序性细胞死亡是以凋亡的方式进行，但并不是所有的程序性死亡都采取凋亡的方式。有的程序性死亡都采取凋亡的方式。6如烟草蛾节

8、间肌肉细胞、哺乳动物某些神经元和红细胞，它们的程序性死亡是以非非凋凋亡亡的方式进行。有时由外源性理化因子刺激诱发的细胞死亡，形态上似凋亡，但并不是由细胞内原原装装程程序序所引发，也不能称为程序性细胞死亡（如放疗后肿瘤组织坏死等）。因此细胞凋亡只是程序性死亡的特殊方式。u细胞凋亡细胞凋亡与与细胞程序性死亡细胞程序性死亡l细胞凋亡的生物学意义：细胞凋亡的生物学意义：近年来对细胞凋亡的研究日渐重视，现代研究结果表明：近年来对细胞凋亡的研究日渐重视，现代研究结果表明：细胞凋亡不仅是认识细胞死亡过程的基础，而且在细胞凋亡不仅是认识细胞死亡过程的基础，而且在胚胎发胚胎发育、造血、免疫、乃至肿瘤形成中育、造

9、血、免疫、乃至肿瘤形成中都有极为重要的作用。都有极为重要的作用。1.1.确保正常的生长发育确保正常的生长发育(development)(development)：清除无用、多余的细胞。2.2.维持内环境稳定维持内环境稳定(maintenance of homeostasis)(maintenance of homeostasis)：清除受损、突变或衰老的细胞。3.3.发挥积极的防御功能发挥积极的防御功能(defense reaction)(defense reaction)：清除病毒感染细胞等对机体有害的细胞。8 Sculpting the digits in the developing m

10、ouse paw by apoptosis.Tissue remodeling.The resorption of the tadpole tail at the time of its metamorphosis into a frog occurs by apoptosis.Elimination of transitory organs and tissues.细胞凋亡参与皮肤更新细胞凋亡参与皮肤更新2.细胞凋亡的生物学特征l l形态学变化形态学变化l l生物化学变化生物化学变化胞内胞内胞内胞内CaCaCaCa+浓度增高浓度增高浓度增高浓度增高 DNADNADNADNA片段化片段化片段化

11、片段化 大分子的合成大分子的合成大分子的合成大分子的合成(凋亡相关蛋白质及凋亡相关蛋白质及凋亡相关蛋白质及凋亡相关蛋白质及RNARNARNARNA合成）合成）合成）合成）tTGtTGtTGtTG（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高的水平。的水平。的水平。的水平。一种依赖一种依赖一种依赖一种依赖钙离子的酶，钙离子的酶，钙离子的酶，钙离子的酶，当凋亡起始时，当凋亡起始时，当凋亡起始时，当凋亡起始时，CaCa+浓度上升，从而使浓度上升，从而使浓度上升，从而使浓度上升，从而使tTGtTG活化。其

12、活化。其活化。其活化。其作用是保持凋亡小体的完整性，防止有作用是保持凋亡小体的完整性，防止有作用是保持凋亡小体的完整性，防止有作用是保持凋亡小体的完整性，防止有害物质的逸出。害物质的逸出。害物质的逸出。害物质的逸出。14lMorphologicalChanges(细胞生物学详讲细胞生物学详讲)l第一阶段第一阶段：胞体缩小与周围细胞失去联系，细胞器变：胞体缩小与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小块。表面下，形成新月形致密小块。l第二阶段第二阶段：染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹：染色体

13、断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分胞内成分(胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜)形成形成“泡泡”样结构，此为样结构，此为“凋亡小体凋亡小体”。最后，整个细胞。最后，整个细胞均裂解成这种均裂解成这种“小体小体”。l第三阶段第三阶段：凋亡小体被邻近的巨噬、上皮细胞等识别、：凋亡小体被邻近的巨噬、上皮细胞等识别、吞噬、消化。上述三个阶段维持时间很短，通常在吞噬、消化。上述三个阶段维持时间很短，通常在几几分钟、十几分钟内分钟、十几分钟内即可完成。即可完成。15细胞凋亡时的形态学变化细胞凋亡时的形态学变化16u 细胞凋亡细胞凋亡与与细胞坏死细胞坏死特征特征特征特征 细胞

14、凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死细胞坏死细胞坏死诱导因素诱导因素 生理及弱刺激生理及弱刺激 强烈刺激强烈刺激受累范围受累范围 单个单个细胞丢失细胞丢失 成群细胞死亡成群细胞死亡膜完整性膜完整性 保持到晚期保持到晚期 早期即丧失早期即丧失细胞体积细胞体积 减少、固缩减少、固缩 增大肿胀增大肿胀染色质染色质 凝聚成半月形凝聚成半月形 稀疏成网状稀疏成网状细胞器细胞器 无明显变化无明显变化 肿涨破坏肿涨破坏溶酶体溶酶体 保持完整保持完整 破坏外溢破坏外溢细胞形状细胞形状 形成凋亡小体形成凋亡小体 破裂成碎片破裂成碎片基因组基因组DNA DNA 有控降解有控降解 随机降解随机降解大分子合

15、成大分子合成 一般需要一般需要 不需要不需要基因调控基因调控 有有 无无后果后果 不引起炎症反应不引起炎症反应 引起炎症反应引起炎症反应意义意义 生理死亡方式生理死亡方式 病理死亡方式病理死亡方式171819DNAladderDNA fragmentationchromatinDNAcore histonenucleosome 180bpendonucleolytic203.3.细胞凋亡的诱导和抑制因素细胞凋亡的诱导和抑制因素物理性因子，包括射线（紫外线，物理性因子，包括射线（紫外线，射线等），较温射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等；和的温度刺激（如热激，冷激）等；化学及生物因子：包

16、括活性氧基团和分子，激素，细化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF）等。）等。DNA和蛋白质合成的抑制剂等。和蛋白质合成的抑制剂等。214.4.免疫相关的凋亡信号转导免疫相关的凋亡信号转导l l接受凋亡信号接受凋亡信号接受凋亡信号接受凋亡信号l l凋亡调控分子间的相互作用凋亡调控分子间的相互作用凋亡调控分子间的相互作用凋亡调控分子间的相互作用l l蛋白水解酶（蛋白水解酶（蛋白水解酶（蛋白水解酶（caspasescaspasescaspasescaspases）的活化）的活化）的活化）的活化l l凋亡的级联反应凋亡的级联反应凋亡的级

17、联反应凋亡的级联反应22p免疫相关的凋亡信号途径免疫相关的凋亡信号途径l l死亡受体介导的信号途径死亡受体介导的信号途径l l线粒体途径线粒体途径l l颗粒酶颗粒酶B途径途径(CTLCTLCTLCTL特有特有特有特有)23n死亡受体通路、线粒体通路死亡受体通路、线粒体通路24l l其中其中膜受体膜受体和和线粒体线粒体途径均通过激活含途径均通过激活含半胱氨半胱氨酸的天冬氨酸酶酸的天冬氨酸酶（Caspase）剪切胞内底物（）剪切胞内底物（CaspaseCaspaseCaspaseCaspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程不可逆有限水解底物的级联放大反应过程不可逆有限水解底物的级联放大反应过

18、程不可逆有限水解底物的级联放大反应过程），导致凋亡特有的生化和形态学改变。，导致凋亡特有的生化和形态学改变。p细胞凋亡涉及的共同通路细胞凋亡涉及的共同通路25l lCaspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶，水含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸解底物天冬氨酸C端肽键，因此又称之为端肽键，因此又称之为Caspases(取英文取英文CysteineC，asparticacid，Asp，proteases的词头的词头)p细胞凋亡涉及的共同通路细胞凋亡涉及的共同通路2627CaspaseCaspase家族的结构与分类家族的结构与分类lICE亚类Caspase蛋白酶：ICE是单核细胞来源的参与

19、成熟的一种蛋白酶，参与凋亡但不起主要作用；Caspase1Caspase1，Caspase4Caspase4，Caspase5Caspase5，Caspase11 Caspase11 Caspase12Caspase12，Caspase13Caspase13，Caspase14Caspase14。l l凋亡启动亚类凋亡启动亚类Caspase蛋白酶蛋白酶（上游（上游（上游（上游CaspaseCaspaseCaspaseCaspase）：Caspase8Caspase8，Caspase2Caspase2，Caspase 9Caspase 9，Caspase10Caspase10。l l凋亡效应亚类

20、凋亡效应亚类Caspase蛋白酶蛋白酶（下游（下游（下游（下游CaspaseCaspaseCaspaseCaspase）：Caspase3Caspase3，Caspase6Caspase6，Caspase7Caspase728CaspaseCaspase家族的特点：家族的特点：l l以酶原的形式存在，需要活化：以酶原的形式存在，需要活化：以酶原的形式存在，需要活化：以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和异源活化同源活化和异源活化同源活化和异源活化同源活化和异源活化,活化后形成四聚体活化后形成四聚体活化后形成四聚体活化后形成四聚体的蛋白水解酶，发挥生物学作用的蛋白水解酶，发挥生物学作用的蛋白水解

21、酶，发挥生物学作用的蛋白水解酶，发挥生物学作用l lC C C C端同源区存在半胱氨酸激活位点端同源区存在半胱氨酸激活位点端同源区存在半胱氨酸激活位点端同源区存在半胱氨酸激活位点 29 CaspaseCaspase活化机制：活化机制：l lCaspaseCaspaseCaspaseCaspase的活化是有顺序的多步水解的过程，虽的活化是有顺序的多步水解的过程，虽的活化是有顺序的多步水解的过程，虽的活化是有顺序的多步水解的过程，虽然分子各异，但是它们活化的过程相似。然分子各异，但是它们活化的过程相似。然分子各异，但是它们活化的过程相似。然分子各异，但是它们活化的过程相似。l l首先在首先在首先在

22、首先在caspasecaspasecaspasecaspase前体的前体的前体的前体的N-N-N-N-端前肽和大亚基之间的端前肽和大亚基之间的端前肽和大亚基之间的端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除特定位点被水解去除特定位点被水解去除特定位点被水解去除N-N-N-N-端前肽，然后再在大小亚端前肽，然后再在大小亚端前肽，然后再在大小亚端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成的有活性的四聚体的有活性的四聚体的有活性的四聚体的有活性的四聚体,3031

23、凋亡细胞的特征性表现：包括DNA裂解为200bp左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化，细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，然后，这些凋亡小体被其他细胞所吞噬。l破坏细胞抗凋亡因素l破坏细胞结构l影响核酸的结构与功能 CaspaseCaspase的效应机制的效应机制32破坏细胞抗凋亡因素破坏细胞抗凋亡因素l正常活细胞内核酸酶处于无活性状态正常活细胞内核酸酶处于无活性状态。这是由于核。这是由于核酸酶和抑制物结合在一起（如抑制物被破坏，核酸酸酶和抑制物结合在一起（如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起酶即可激活，引起DNADNA片段化）。片段化）。l现知现知caspasecaspase可以可以剪切

24、剪切裂解这种抑制物而激活核酸裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为酶，因而把这种酶称为CaspaseCaspase激活的脱氧核糖核激活的脱氧核糖核酸酶酸酶（caspase-activated deoxyribonulease caspase-activated deoxyribonulease CADCAD），而把它的抑制物称为），而把它的抑制物称为ICADICAD。l有意义的是有意义的是CADCAD只在只在ICADICAD存在时才能合成并显示活存在时才能合成并显示活性，因而性，因而ICADICAD对对CADCAD的活化与抑制是必需的的活化与抑制是必需的。33破坏细胞结构破坏细胞结构lC

25、aspaseCaspase可直接破坏细胞结构：如裂解可直接破坏细胞结构：如裂解核纤层核纤层核纤层（核纤层（LaminLamin）是由核纤层蛋白通过聚合作用而是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质（染色质（chromatinchromatin）得以形成并进行正常的排列。）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被CaspaseCaspase裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色染色质的固缩质的固缩。34影响核

26、酸的结构与功能影响核酸的结构与功能l lCaspaseCaspaseCaspaseCaspase可作用于多种与可作用于多种与可作用于多种与可作用于多种与DNADNADNADNA、RNARNARNARNA功能有关的蛋白：功能有关的蛋白：功能有关的蛋白：功能有关的蛋白：如灭活或下调与如灭活或下调与如灭活或下调与如灭活或下调与DNADNADNADNA修复有关的酶、修复有关的酶、修复有关的酶、修复有关的酶、mRNAmRNAmRNAmRNA剪切剪切剪切剪切蛋白和蛋白和蛋白和蛋白和DNADNADNADNA交联蛋白。交联蛋白。交联蛋白。交联蛋白。由于由于由于由于DNADNADNADNA的作用，这些蛋白功能被

27、抑制，使细的作用，这些蛋白功能被抑制，使细的作用，这些蛋白功能被抑制，使细的作用，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。354.14.1死亡受体的信号转导死亡受体的信号转导(1).参与死亡受体信号转导的接头蛋白参与死亡受体信号转导的接头蛋白参与死亡受体信号转导的接头蛋白参与死亡受体信号转导的接头蛋白：（死亡结构域蛋白death domain protein）lTRADD：TNF受体相关死亡结构域蛋白TNF+TNFRI（死亡结构域）+TRADD细胞凋亡lFADD：Fas相关死亡结构域蛋白Fa

28、sL+Fas（死亡结构域）+FADD 细胞凋亡lRIP：受体相互作用蛋白lCRADD：含有死亡结构域的caspase和RIP接头蛋白lMADD：活化MAP激酶的死亡结构域蛋白36(2).(2).死亡受体通路死亡受体通路受体多聚化受体多聚化受体多聚化受体多聚化和构像改变和构像改变和构像改变和构像改变死亡受体死亡受体死亡受体死亡受体/配体配体配体配体/FADD/Caspase8/FADD/Caspase8/FADD/Caspase8/FADD/Caspase8或或或或10101010+FADDlFASL+FASl凋亡诱导复合物（DISC）l胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上细胞有足够c

29、aspase8 细胞caspase8浓度不够死亡受体活化，细胞凋亡切割Bid tBid从胞质到线粒体 CtyC 释放线粒体途径线粒体途径37FasL/Fas38(3).(3).死亡受体途径的调控机制死亡受体途径的调控机制lFLIPFADD-like-IL-1-converting-enzyme(FLICE)inhibitory proteinl近年发现的含DED的凋亡抑制蛋白l广泛存在于真核生物、哺乳动物细胞和病毒中l包括：病毒基因编码的FLIP(v-FLIP)l 细胞FLIP(c-FLIP):c-FLIPS或c-FLIPLl功能：抑制功能：抑制Caspase8Caspase8结合到结合到DI

30、SCDISC上，从而抑制上，从而抑制起始起始CaspaseCaspase激活。激活。394.2 4.2 线粒体途径线粒体途径(1).(1).基本环节：基本环节：l释放caspase活化因子l细胞色素C：细胞色素C+Apaf-1+caspase9凋亡体lAIF（凋亡诱导因子）lCaspase3lApaf-1：凋亡蛋白酶活化因子40(2).(2).线粒体通路线粒体通路41(3).(3).线粒体通路的调控机制线粒体通路的调控机制uuBcl-2Bcl-2Bcl-2Bcl-2家族（家族（家族（家族（B cell lymphoma/leukemia-2B cell lymphoma/leukemia-2B

31、 cell lymphoma/leukemia-2B cell lymphoma/leukemia-2）因该家族成员可通过改变外膜通透性而调控因该家族成员可通过改变外膜通透性而调控线粒体活化，故该途径也称为线粒体活化，故该途径也称为Bcl-2Bcl-2介导的线粒体介导的线粒体途径。途径。Bcl-2Bcl-2家族已发现家族已发现1515个成员，所有个成员，所有Bcl-2Bcl-2家族家族成员均含有成员均含有1 1个或多个个或多个BHBH结构域。结构域。42根据结构和功能分为两类：l抗凋亡抗凋亡/促增殖成员：促增殖成员：包括 Bcl-2、Bcl-xl 等。机制机制：可阻止线粒体外膜通透化，从而阻止

32、细胞色素C的释放，抑制细胞凋亡。l促凋亡成员：促凋亡成员：包括包括BidBid、BimBim、BadBad等等“BH3onlyBH3only”蛋白质蛋白质和和Bax、Bak、Bok等“多BH”蛋白质机制机制：影响APAF1的功能 影响线粒体的结构与功能434445uu IAP IAP（inhibitor of apoptosisinhibitor of apoptosisinhibitor of apoptosisinhibitor of apoptosis，细胞凋亡抑制因子），细胞凋亡抑制因子），细胞凋亡抑制因子），细胞凋亡抑制因子）IAPIAP超家族的成员较多，共同的特征是含有一个超家族的

33、成员较多，共同的特征是含有一个或多个个氨基酸的重复序列（或多个个氨基酸的重复序列（BIRBIR），类似于），类似于zinczinc指状的结构。指状的结构。BIRBIR功能域和之间的连接区域介导对功能域和之间的连接区域介导对caspasecaspase的抑的抑制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导用，介导caspasecaspase-和和-的泛素化降解作用。的泛素化降解作用。46l(3)Smac/Dablol 在细胞凋亡过程中它可以从线粒体释放进入细胞质。l 成熟的Smac蛋白产生一个新的N基端,这个N基端的前面4个氨基酸可以与lAP

34、的BIR结构域结合。l Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9与lAP的结合。Smac 与BIR2的结合可以中和XlAP对胱解酶9的抑制，促进凋亡。48(4)AIF(apoptosis-inducing factor)Endo G 两者均由线粒体释放，可以非Caspase依赖方式介导染色质的浓集和DNA片段化，促进凋亡。49颗粒酶颗粒酶B途径凋亡途径凋亡l颗粒酶B属丝氨酸蛋白酶l可作用于底物的天冬氨酸残基位点l是CTL杀伤靶细胞的主要效应分子。l机制:(1)颗粒酶B直接剪切并激活Caspase-3,后者作用于胞内底物介导凋亡l(2)颗粒酶B剪切Bid而产生tBid,后者与Bax转位于线粒体，介导细

35、胞色素C释放，激活Caspase级联反应。50l细胞凋亡发生于在淋巴细胞分化、发育成熟及增殖和行使免疫学效应的全过程中；l细胞凋亡在免疫系统成熟、受体多样性选择以及免疫自稳等方面均有重要作用；l研究免疫系统凋亡机制将为探讨包括肿瘤、自身免疫病、艾滋病等免疫相关疾病的发生机理进而发展有效的防治方案提供依据。二细胞凋亡与免疫生理二细胞凋亡与免疫生理51二细胞凋亡与免疫生理二细胞凋亡与免疫生理l1.细胞凋亡与细胞凋亡与T细胞细胞l（1）凋亡与）凋亡与T细胞在胸腺的分化发育：细胞在胸腺的分化发育：52（2）凋凋亡亡与与成成熟熟T细细胞胞：活化T细胞表面高表达fas及fasL。AICDl1.细胞凋亡与细

36、胞凋亡与T细胞细胞53l2.细胞凋亡与细胞凋亡与B细胞细胞l（1）凋亡与骨髓中B细胞发育：l（2）凋亡与成熟B细胞54l3.细胞凋亡与淋巴细胞的细胞毒作用细胞凋亡与淋巴细胞的细胞毒作用：l 有胞毒作用的淋巴细胞主要有CTL、NK、LAK细胞等。它们产生效应的机制相似：lCa+内流内流释放穿孔素释放穿孔素6-16nm孔孔靶细胞死亡靶细胞死亡l靶细胞凋亡靶细胞凋亡ll颗粒酶（丝氨酸酶）颗粒酶（丝氨酸酶）激活激活caspaseTNF相关蛋白相关蛋白llTc高表达高表达FasL55三细胞凋亡与免疫病理三细胞凋亡与免疫病理细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡不足不足不足不足及细胞凋亡及细胞凋亡及细胞凋亡及细

37、胞凋亡过度过度过度过度都会造成都会造成都会造成都会造成疾病疾病疾病疾病2004 0481proliferationapoptosishomeostasis time 与凋亡与凋亡与凋亡与凋亡不足不足不足不足有关的疾病有关的疾病有关的疾病有关的疾病 与凋亡与凋亡与凋亡与凋亡过度过度过度过度有关的疾病有关的疾病有关的疾病有关的疾病1 1 肿瘤肿瘤肿瘤肿瘤 1 AIDS1 AIDS滤泡型淋巴瘤滤泡型淋巴瘤滤泡型淋巴瘤滤泡型淋巴瘤 2 2 神经变性疾病神经变性疾病神经变性疾病神经变性疾病激素依赖性肿瘤（乳瘤）激素依赖性肿瘤（乳瘤）激素依赖性肿瘤（乳瘤）激素依赖性肿瘤（乳瘤）巴金森氏病巴金森氏病巴金森氏

38、病巴金森氏病2 2 自身免疫病自身免疫病自身免疫病自身免疫病 色素性视网膜炎色素性视网膜炎色素性视网膜炎色素性视网膜炎系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮 3 3 再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血免疫介导的肾小球肾炎免疫介导的肾小球肾炎免疫介导的肾小球肾炎免疫介导的肾小球肾炎 4 4 缺血性损伤缺血性损伤缺血性损伤缺血性损伤3 3 病毒感染病毒感染病毒感染病毒感染 心肌梗死，中风心肌梗死，中风心肌梗死，中风心肌梗死，中风疱疹病毒，腺病毒疱疹病毒，腺病毒疱疹病毒，腺病毒疱疹病毒，腺病毒 5 5 酒精中毒性肝病酒精中毒性肝病酒精中毒性肝病酒精中毒性肝病5

39、7凋亡不足与过度并存：凋亡不足与过度并存：动脉粥样硬化（内皮细胞动脉粥样硬化（内皮细胞凋亡过度，血管平滑肌细胞凋亡不足）凋亡过度，血管平滑肌细胞凋亡不足）57针对疾病种类的不同，可以通过抑制或者增强细胞针对疾病种类的不同，可以通过抑制或者增强细胞针对疾病种类的不同，可以通过抑制或者增强细胞针对疾病种类的不同，可以通过抑制或者增强细胞凋亡的措施治疗有关的疾病凋亡的措施治疗有关的疾病凋亡的措施治疗有关的疾病凋亡的措施治疗有关的疾病：1 1 1 1 诱导细胞凋亡治疗因凋亡受抑而致的疾病诱导细胞凋亡治疗因凋亡受抑而致的疾病诱导细胞凋亡治疗因凋亡受抑而致的疾病诱导细胞凋亡治疗因凋亡受抑而致的疾病放疗和化

40、疗能激活肿瘤自杀程序，导致瘤细胞凋亡。改变细胞凋亡状态用于疾病治疗的许多措施尚属试用阶段。改变细胞凋亡状态用于疾病治疗的许多措施尚属试用阶段。改变细胞凋亡状态用于疾病治疗的许多措施尚属试用阶段。改变细胞凋亡状态用于疾病治疗的许多措施尚属试用阶段。一个十分诱人的设想是一个十分诱人的设想是一个十分诱人的设想是一个十分诱人的设想是基因治疗基因治疗基因治疗基因治疗通过通过通过通过载体导入凋亡相载体导入凋亡相载体导入凋亡相载体导入凋亡相关基因关基因关基因关基因干预细胞的凋亡调控来实现。干预细胞的凋亡调控来实现。干预细胞的凋亡调控来实现。干预细胞的凋亡调控来实现。2 2 2 2 抑制细胞凋亡治疗因凋亡过量

41、而致的疾病抑制细胞凋亡治疗因凋亡过量而致的疾病抑制细胞凋亡治疗因凋亡过量而致的疾病抑制细胞凋亡治疗因凋亡过量而致的疾病神经生长因子治疗神经系统退行性病变，可以延缓神经元凋亡。58四细胞凋亡研究方法四细胞凋亡研究方法l形态学方法形态学方法l生物化学方法生物化学方法l免疫学方法免疫学方法l组织化学方法组织化学方法l分子生物学方法分子生物学方法5960l1.形态学方法形态学方法l1）光学显微镜观察光学显微镜观察l样品涂片或组织切片经常规处理、样品涂片或组织切片经常规处理、样品涂片或组织切片经常规处理、样品涂片或组织切片经常规处理、HEHE染色后染色后染色后染色后,即可放即可放即可放即可放在油镜下观察

42、。在油镜下观察。在油镜下观察。在油镜下观察。l l该方法简便该方法简便该方法简便该方法简便,缺点是只有在发现了具有缺点是只有在发现了具有缺点是只有在发现了具有缺点是只有在发现了具有特征性的凋亡小特征性的凋亡小特征性的凋亡小特征性的凋亡小体时体时体时体时才能确定为才能确定为才能确定为才能确定为荧光结果阳性荧光结果阳性荧光结果阳性荧光结果阳性,因而因而因而因而不易检出早期的凋亡细不易检出早期的凋亡细不易检出早期的凋亡细不易检出早期的凋亡细胞胞胞胞,而且某些类型的细胞坏死而且某些类型的细胞坏死而且某些类型的细胞坏死而且某些类型的细胞坏死(如凝固性坏死如凝固性坏死如凝固性坏死如凝固性坏死)与细胞凋亡形

43、与细胞凋亡形与细胞凋亡形与细胞凋亡形态相似态相似态相似态相似,两者不易区分。因此两者不易区分。因此两者不易区分。因此两者不易区分。因此,该方法只能作为该方法只能作为该方法只能作为该方法只能作为细胞凋亡初细胞凋亡初细胞凋亡初细胞凋亡初步推测的手段步推测的手段步推测的手段步推测的手段。6162l1.形态学方法形态学方法l2）荧光显微镜观察：荧光显微镜观察：l荧光染料吖啶橙荧光染料吖啶橙(AO)、碘化丙啶、碘化丙啶(PI)、溴化乙锭、溴化乙锭(EB)等染色等染色,在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞的细在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞的细胞核改变和凋亡小体的形成。胞核改变和凋亡小体的形成。l这种方法这种方法

44、适用于对体外培养细胞悬液适用于对体外培养细胞悬液的检测的检测,组织组织脱蜡切片经脱蜡切片经RNA酶作用后也可用此法染色观察。酶作用后也可用此法染色观察。l荧光显微镜检查法方便易行荧光显微镜检查法方便易行,现已成为细胞凋亡检现已成为细胞凋亡检查的常用手段。查的常用手段。63 On this slide the easiest and historically first way of identifying apoptotic cells is shown.In this assay the blue fluorescent dye DAPI(4,6-Diamidine-2-phenylindo

45、le dihydrochloride)has been used,which specifically stains DNA.64l1.形态学方法形态学方法l3）透射电子显微镜观察：）透射电子显微镜观察：l凋亡细胞在电子显微镜下可见细胞体积变小凋亡细胞在电子显微镜下可见细胞体积变小,细胞细胞质浓缩质浓缩,内质网、线粒体增多内质网、线粒体增多,细胞膜微绒毛消失、起细胞膜微绒毛消失、起泡、出芽、形成凋亡小体。超微结构观察是诊断细胞泡、出芽、形成凋亡小体。超微结构观察是诊断细胞凋亡最可靠的方法。凋亡最可靠的方法。l但该法只能定性但该法只能定性,不能定量不能定量,而且观察到凋亡小体而且观察到凋亡小体的

46、几率也不高的几率也不高,在体内试验时在体内试验时,凋亡小体可能很快被巨凋亡小体可能很快被巨噬细胞吞噬清除噬细胞吞噬清除,而不易观察到而不易观察到;此外此外,用电子显微镜检用电子显微镜检测细胞凋亡测细胞凋亡,样品制备步骤繁琐、耗时、昂贵。样品制备步骤繁琐、耗时、昂贵。6566l1.形态学方法形态学方法l4）共聚焦激光扫描显微镜检测：）共聚焦激光扫描显微镜检测：l 共聚焦激光扫描显微镜是20 世纪80 年代发展起来的一种新型仪器,是在荧光显微镜的基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使紫外光和可见光激发荧光探针,从而得到清晰的细胞内部结构。l该方法能用于细胞的形态学分析,而且还能对凋亡

47、细胞内的大分子进行定位。67l2.生物化学方法：生物化学方法：l（1）典型的细胞凋亡显示出DNA梯形电泳图谱：细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂,形成180200 bp 长的DNA片段或整数倍的寡核苷酸片段。凋亡细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的梯形电泳图谱,而坏死细胞电泳后呈模糊的涂片状68细胞色素细胞色素c诱导的凋亡细胞诱导的凋亡细胞DNA电泳图电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照

48、7Marker （自赵允、翟中和）6970l2.生物化学方法：生物化学方法：l（2）原位末端转移酶标记技术：）原位末端转移酶标记技术：l凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活，核DNA被切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口)，暴露出大量3末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记的-dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。71l2.生物化学方法：生物化学方法：l由由DNA DNA 片段末端标记技术发展而成的片段末端标记技术发展而成的TUNEL TUNEL 法法 termina deoxy nucleotibyl transferase termina de

49、oxy nucleotibyl transferase(TdT)-mediated dUTP-biotin nick end(TdT)-mediated dUTP-biotin nick end labelling,TUNEL labelling,TUNEL 及试剂盒化及试剂盒化,使细胞凋亡使细胞凋亡的原位检测在诸多领域的研究中得到广泛应用。的原位检测在诸多领域的研究中得到广泛应用。72lTUNEL法原理法原理1.细胞凋亡其断裂细胞凋亡其断裂DNA断端断端3-OH暴露暴露(坏死细胞坏死细胞DNA DNA 断裂是无规则的断裂是无规则的,其中也有少数可出现其中也有少数可出现3-OH 3-OH 的暴

50、露的暴露,但数量极微弱但数量极微弱,不易检测出来不易检测出来);2.在末端在末端DNA转移酶转移酶(TdT)的作用下的作用下,在无需模板的在无需模板的情况下情况下,可进行可进行3端的端的DNA合成合成;3.如果在反应体系中加入标记的如果在反应体系中加入标记的DNA,则在则在3端出现端出现一段带有标记物的寡核苷酸一段带有标记物的寡核苷酸,通过通过荧光显示或其他显色荧光显示或其他显色反应反应,可以可以原位地较特异地显示发生凋亡的细胞原位地较特异地显示发生凋亡的细胞。73lTUNEL法优点法优点:l特异性特异性:该法用生化方法特异地标记凋亡细该法用生化方法特异地标记凋亡细胞胞,可以将凋亡细胞、坏死细