基于非损伤微测技术的拟南芥根毛细胞硝态氮和铵态氮吸收检测方法(T-ZFL 022—2023).pdf

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1、 ICS 7.08 CCS ZFL A 0519 中关村旭月非损伤微测技术产业联盟团体标准 T/ZFL 0222023 基于非损伤微测技术的拟南芥根毛细胞 硝态氮和铵态氮吸收检测方法 Detection method for the uptake of nitrate and ammonium in Arabidopsis root hair cells by non-invasive micro-test technology 2023-02-28 发布 2023-03-01 实施 中关村旭月非损伤微测技术产业联盟 发 布 T/ZFL 0222023 I 前言 本文件按照GB/T 1.120

2、20标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由东北农业大学提出。本文件由中关村旭月非损伤微测技术产业联盟归口。本文件起草单位：东北农业大学、浙江农林大学、中国林业科学研究院。本文件主要起草人：周爱民，胡雪菲，冯爽，吕馥龄，刘华，张海珍，乔坤。本标准与T/ZFL 022-2022相比，主要变化如下：调整了本文件的主要起草人。T/ZFL 0222023 1 基于非损伤微测技术的拟南芥根毛细胞 硝态氮和铵态氮吸收检测方法 1 范围 本标准规定了一种使用非损伤微测技术检测拟南芥Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.根毛细胞硝态氮和铵态氮吸收的检测方法

3、。本标准适用于拟南芥氮素营养吸收和转运研究。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4793 电子测量仪器安全要求 GB 6587.7 电子测量仪器 基本安全实验 GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 GB/T 601-2002 化学试剂 标准滴定溶液的制备 GB/T 603-2002 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 12519-2

4、010 分析仪器通用技术条件 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 有机态氮 organic nitrogen 有机态氮是指有机化合物中所含有的氮元素。3.2 无机态氮 inorganic nitrogen 无机态氮是指无机化合物中所含有的氮元素。T/ZFL 0222023 2 3.3 硝态氮 nitrate nitrogen 自然界氮元素的一种存在形态，以硝酸根离子(NO3-)的形态存在和流通于土壤、植物、肥料和大气中。3.4 铵态氮 ammonium nitrogen 自然界氮元素的一种存在形态，以铵根离子(NH4+)的形态存在和流通于土壤、植物、肥料和大气中。3.5 根毛区

5、 root hair zone 根毛区是植物根系吸收水分和无机盐的主要部位，根毛扩大了吸收的面积。3.6 离子流速 ion flux 每一秒钟通过一个平方厘米的该离子/分子皮摩尔数。3.7 实验组 experimental group 进行某种条件处理或者基因转化的拟南芥组，是在研究一个条件对拟南芥影响的实验中的实验对象。3.8 对照组 control group 指不做任何条件处理或基因转化的野生型拟南芥组。3.9 测试液 test fluid 测试液指样品在使用非损伤微测技术离子流速监测过程中所处的液体环境，保证非损伤微测系统正常工作。维持一定的渗透压和pH值，以保证样品的活性。一定情况下

6、（如本标准）也可以直接充当植物样品的瞬时处理液。3.10 自变量 independent variable 由实验者操控掌握的变量，即3.7中所提及的某种处理以及基因转化。3.11 非损伤微测系统 Non-invasive Micro-test TechnologyT/ZFL 0222023 3 用于检测活体生物、非生物材料表面微观区域特定离子分子扩散方向及速率的技术，即离子分子“流速”。常用于检测活体生物组织、细胞表面的离子分子跨膜转运，非生物材料表面离子分子的扩散，可用于研究基因、蛋白生理功能、材料表面腐蚀机理等。检测灵敏度为10-1210-15molcm-2s-1，空间分别率为0.1m。

7、4 方法原理 土壤中的氮素分为有机态氮和无机态氮，有机态氮与有机质和粘土矿物相结合，或与多价阳离子形成复合体，难以分解，并不能大量被作物直接吸收利用。而植物可以大量吸收利用的无机态氮有硝态氮（NO3-)和铵态氮（NH4+)两种形式。根毛区是植物吸收氮素的主要部位，所以我们研究活体拟南芥根毛细胞的 NO3-和 NH4+离子流速，可以判断各种处理条件或者相关基因对拟南芥不同种氮素吸收的影响。在不同浓度氮环境下，拟南芥对氮素吸收和利用途径的调控有所不同。所以首先将实验组和对照组拟南芥种子在充足氮和氮饥饿条件下培养，获得拟南芥幼苗，分别用 NO3-溶液NO3-测试液（含有 KNO3）或 NH4+溶液N

8、H4+测试液（含有 NH4Cl）处理这些幼苗，将 NO3-或 NH4+作为唯一氮源，利用非损伤微测技术测量这两组拟南芥初生根根毛区的 NO3-或 NH4+离子流速。则可以判断出实验组拟南芥幼苗相对于对照组，在何种氮素条件下，影响了哪种无机态氮的吸收。为了更充分的调查，同样在充足氮和氮饥饿条件下培养拟南芥幼苗，同时给予实验组和对照组拟南芥幼苗 NO3-和 NH4+离子，即用 NH4NO3溶液（NO3-和 NH4+测试液（含有 NH4NO3）处理幼苗，测量拟南芥初生根根毛区的 NO3-和 NH4+离子流速。则可以分析出，实验组拟南芥幼苗相对于对照组来说，在何种氮素条件下，更优先影响哪种无机态氮的吸

9、收。5 试剂和材料 本标准所用试剂和水，除另有规定外，所用试剂均为分析纯。实验用水均符合 GB/T 6682-2008 一5.1 级水规定。1/2MS（氮充足）培养基（配制方法见附录 A 中的 A.1）。5.2 1/2MS（Nfree）培养基（配制方法见附录 A 中的 A.2）。5.3 5.4 校正液 1 配方（含有KNO3）：0.5mM KNO3、0.1mM KCl、0.3mM 2-吗啉乙磺酸、0.1mM CaCl2，液体环境的pH值调节到6.0，现配现用。5.5 校正液 2 配方（含有KNO3）：0.05mM KNO3、0.1mM KCl、0.3mM 2-吗啉乙磺酸、0.1mM CaCl2

10、，液体环境的pH值调节到6.0，现配现用。5.6 测试溶液配方（含有KNO3）：0.1mM KNO3、0.1mM KCl、0.3mM 2-吗啉乙磺酸、0.1mM CaCl2，液体环境的pH值调节到6.0，现配现用。5.7 校正液 3 配方（含有NH4Cl）：0.5mM NH4Cl、0.3mM 2-吗啉乙磺酸、0.1mM CaCl2、液体环境的pH值调节到6.0，现配现用。5.8 校正液 4 配方（含有NH4Cl）：0.05mM NH4Cl、0.3mM 2-吗啉乙磺酸、0.1mM CaCl2、液体环境的pH值调节到6.0，现配现用。T/ZFL 0222023 4 5.9 测试溶液配方（含有NH4

11、Cl）：0.1mM NH4Cl、0.3mM 2-吗啉乙磺酸、0.1mM CaCl2、液体环境的pH值调节到6.0，现配现用。5.10 校正液 5 配方（含有 NH4NO3）：0.5mM NH4NO3、0.3mM 2-吗啉乙磺酸、0.1mM CaCl2,液体环境的 pH值调节到 6.0，现配现用。5.11 校正液 6 配方（含有 NH4NO3）：0.05mM NH4NO3、0.3mM 2-吗啉乙磺酸、0.1mM CaCl2，液体环境的pH 值调节到 6.0，现配现用。5.12 测试溶液配方（含有 NH4NO3）：0.1mM NH4NO3、0.3mM 2-吗啉乙磺酸、0.1mM CaCl2，液体环

12、境的pH 值调节到 6.0，现配现用。5.13 实验常用生化试剂。5.14 液体量取器材及其他消耗品：移液枪与枪头、容量瓶、烧杯、35/60/90mm 塑料培养皿、镊子、滤纸、滤膜、样品固定专用树脂块、胶布等。6 仪器设备 a)非损伤微测系统：基于非损伤微测技术、检测精度在10-12molcm-2s-1、可自动识别样品根尖分生区、可直接输出流速数据的仪器设备；b)生物倒置显微镜；c)精密三维位移平台；d)铵根离子选择性流速传感器；e)硝酸根离子选择性流速传感器；f)灭菌锅（灭菌温度：105135，工作压力：0.35MPa）；g)电子天平（感量 0.0001g）；h)掌式离心机；i)4冰箱（温控

13、范围 28）；j)人工气候箱（温度：22，12h 光照/12h 黑暗处理）；k)超净工作台。7 试验准备 消毒拟南芥种子 7.1 在超净工作台中进行种子消毒。将拟南芥种子置于1.5mL离心管管底，用移液器加入1mL75乙醇，上下晃动30 s,用掌式离心机离心，使种子重新置于管底，吸出乙醇。再向离心管中加入1mLNaClO溶液，上下晃动3 min，用掌式离心机离心，并吸出NaClO溶液。最后用无菌水清洗五次。拟南芥培养 7.2 将消毒好的种子接种在 1/2MS（氮充足）和 1/2MS（无氮）培养基中，并放在 4 冰箱春化两天。春化结束后，在温度为 22，光周期为 12 h 光照/12 h 黑暗的

14、人工气候箱中培养 10 d。样品驯化 7.3 挑选长势一致的拟南芥 10 d 幼苗，用蒸馏水进行缓苗处理。8 试验步骤T/ZFL 0222023 5 样品处理 8.1 8.1.1 检测 NO3-离子流速 1）充足氮条件下培养的实验组和对照组拟南芥幼苗，用含有KNO3的N03-测试液处理10min（瞬时处理并平衡）。2）缺氮条件下培养的实验组和对照组拟南芥幼苗，用含有 KNO3的 N03-测试液处理 10min（瞬时处理并平衡）。3）充足氮条件下培养的实验组和对照组拟南芥幼苗，用含有 NH4NO3的 NO3-和 NH4+测试液处理 10min（瞬时处理并平衡）。4）缺氮条件下培养的实验组和对照组

15、拟南芥幼苗，用含有 NH4NO3的 NO3-和 NH4+测试液处理 10min（瞬时处理并平衡）。8.1.2 检测 NH4+离子流速 1）充足氮条件下培养的实验组和对照组拟南芥幼苗，用含有 NH4Cl 的 NH4+测试液处理 10min（瞬时处理并平衡）。2）缺氮条件下培养的实验组和对照组拟南芥幼苗，用含有 NH4Cl 的 NH4+测试液处理 10min（瞬时处理并平衡）。3）充足氮条件下培养的实验组和对照组拟南芥幼苗，用含有 NH4NO3的 NO3-和 NH4+测试液处理 10min（瞬时处理并平衡）。4）缺氮条件下培养的实验组和对照组拟南芥幼苗，用含有 NH4NO3的 NO3-和 NH4+

16、测试液处理 10min（瞬时处理并平衡）。样品固定 8.2 a)在 35 mm 塑料培养皿中铺上滤纸条，将平衡处理好的拟南芥放到滤纸条上。b)再铺上一层滤纸条，使拟南芥根部的检测位点处露出。c)使用两块树脂块将根部固定，倒入新鲜测试液，使液面没过样品至少 5 mm 以上。流速检测 8.3 a)将配置好的校正液 1、2 分别倒入两个 35mm 塑料培养皿中。b)按照团体标准非损伤微测技术流速检测设备操作标准 第 3 部分 传感器校准中的规定对 NO3-/NH4+离子选择性流速传感器进行校准操作。c)将固定有被测种子样品的 35mm 塑料培养皿放置在显微镜载物台上，按照团体标准非损伤微测技术流速检

17、测设备操作标准 第 5 部分 流速检测中的规定对被测种子样品做动态NO3-/NH4+流速检测，检测位点是距根毛细胞 0m 处，检测时流速传感器的运动方向垂直于检测位点，每次流速传感器的移动距离为 20m，检测的间隔时间为 6sT/ZFL 0222023 6 10min，每个处理必须测量至少六个以上拟南芥样品的稳定数据，每次测量都要对测量位置进行图片捕获。流速检测完成后，记录好流速数据。9 结果评价 a)将氮充足条件下生长的拟南芥，分别进行 NO3-或 NH4+溶液处理，实验组或对照组对于 NO3-或 NH4+的吸收有所区别，则说明实验自变量影响拟南芥在高浓度氮环境下的 NO3-或 NH4+的吸

18、收。实验可进一步得出结论实验自变量影响的是拟南芥低亲和 NO3-或 NH4+转运系统。b)如将氮缺乏条件下生长的拟南芥，分别进行 NO3-或 NH4+溶液处理，实验组或对照组对于 NO3-或NH4+的吸收有所区别，则说明实验自变量影响拟南芥在低浓度氮环境下的 NO3-或 NH4+的吸收。实验可进一步得出结论实验自变量影响的是拟南芥 NO3-或 NH4+高亲和转运系统。d)如将氮充足条件下生长的拟南芥，进行 NH4NO3溶液处理，实验组或对照组对于 NO3-或 NH4+吸收的区别有一定差异，则说明实验自变量对高浓度氮环境下 NO3-或 NH4+吸收的影响有一定优先顺序。可通过影响的大小进行比对分

19、析。e)如将氮缺乏条件下生长的拟南芥，进行 NH4NO3溶液处理，实验组或对照组对于 NO3-或 NH4+吸收的区别有一定差异，则说明实验自变量对低浓度氮环境下 NO3-或 NH4+吸收的影响有一定优先顺序。可通过影响的大小进行比对分析。可通过递进的一系列数据，研究拟南芥对氮素吸收的特点，提高氮素的利用率。T/ZFL 0222023 7 A A 附录A （资料性）试剂准备 A.1 1/2MS（氮充足）培养基 A.1.1 成分 a)Murashige and Skoog Basal Medium 2.2150g/L b)蔗糖 30g/L c)琼脂粉 10g/L d)水 1000mL A.1.2

20、配置步骤 将各成分加入部分水中，使药品充分溶解，再加水定容至1000mL,调节PH至5.8。向溶液中加入10g琼脂粉，121高压蒸汽灭菌20min,分装备用。A.2 1/2MS（Nfree）培养基 A.2.1 成分 a)Murashige and Skoog Basal Medium without N 2.2150g/L b)蔗糖 30g/L c)琼脂粉 10g/L d)水 1mL A.2.2 配置步骤 将各成分加入部分水中，使药品充分溶解，再加水定容至1000mL,调节PH至5.8。向溶液中加入10g琼脂粉，121高压蒸汽灭菌20min,分装备用。T/ZFL 0222023 8 B B 附

21、录B （资料性）典型流速检测结果 图B.1 充足氮与缺氮条件下培养的野生型（WT）和某转化型拟南芥(2、9、12），以 KNO3和 NH4Cl作为唯一氮源供应后根毛区根毛细胞 NO3-和 NH4+离子流速典型图)从图（B.1 A-D)中可以看出，在 1/2MS 培养基上培养的野生型和转化型幼苗的根毛显示出明显的 NO3 或 NH4+外流，转化和野生型幼苗之间的外流率没有显著差异。而从图（B.1 E-H）可以看出，在 1/2MST/ZFL 0222023 9（N free）培养基培养的野生型和转化型幼苗显示出明显的 NO3 或 NH4+内流，且转化苗的平均流入率显著高于野生型苗。图B.2 充足氮

22、与缺氮条件下培养的野生型（WT）和某转化型拟南芥(2、9、12），以 NO3NH4作为唯一氮源供应后根毛区根毛细胞 NO3-和 NH4+离子流速典型图 从图（B.2 A-D）中可以看出，在 1/2MS 培养基上培养的野生型和转化型幼苗的根毛显示出明显的NO3 或 NH4+外流，转化和野生型幼苗之间的外流率没有显著差异。而从图（B.2 E-H）可以看出，在 1/2MS（N free）培养基培养的野生型和转化型幼苗显示出明显的 NO3 内流，且转化苗的平均流入率显著高于野生型苗。而野生苗和转化苗 NH4+内流水平相似。T/ZFL 0222023 10 由上述现象可以得出这样的结论：该转化基因在低浓

23、度氮素的情况下，发挥作用，可以影响拟南芥对NO3-和NH4+的吸收，对NO3-离子吸收的影响要优先于NH4+离子。图B.3 非损伤微测系统监测拟南芥根毛细胞 NO3-和 NH4+离子流速典型图 T/ZFL 0222023 11 参考文献 1 Ma HP,Zhao JC,Feng S,Qiao K,Gong S,Wang JG*,Zhou AM*.(2020).Heterologous expression of nitrate assimilation related-protein DsNAR2.1/NRT3.1 affects uptake of nitrate and ammonium in nitrogen-starved Arabidopsis.International Journal of Molecular Sciences,21:4027.