茄科植物携带凤果花叶病毒检测技术规程(T-HSPP 0004—2022).pdf

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1、 T/HSPP00042022 茄科植物携带凤果花叶病毒检测技术规程茄科植物携带凤果花叶病毒检测技术规程 Code of Practice for Detection of Pepino mosaic virus carried by Solanaceae plants (发布稿)2022-10-10 发布 2022-11-10 实施 湖 北 省 植 物 保 护 学 会 发布 ICS 65.020.01 CCS B16 团体标准 T/HSPP00042022 I 目次 前言.II 1 范围.-1-2 规范性引用文件.-1-3 术语和定义.-1-4 凤果花叶病毒分类信息.-1-5 仪器和试剂.-

2、1-仪器设备.-1-主要试剂.-1-6 检测流程图.-1-7 检测方法.-1-样品制备.-2-7.1.1 种子类.-2-7.1.2 种苗类.-2-RNA 提取.-2-RT-PCR 检测.-2-分子杂交.-2-结果判定.-3-8 留样保存与结果记录.-3-留样保存.-3-结果记录.-3-建档.-3-附 录 A（参考性附录）凤果花叶病毒基本信息.-4-附 录 B（参考性附录）核酸提取方法.-6-附 录 C（参考性附录）分子杂交方法.-7-附 录 D（规范性性附录）凤果花叶病毒检测流程图.-9-T/HSPP00042022 II 前言 本文件按照GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：

3、标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由武汉海关技术中心提出。本文件由湖北省植物保护学会归口。本文件起草单位：武汉海关技术中心、华中农业大学、武汉理工大学、南京海关动植物与食品检测中心、湖北省阿克瑞德检验检测有限公司。本文件主要起草人：曾宪东、王振华、张华、李乔、王琴、徐文兴、李倩、周旋、郑剑、张建坤、刘振、郑鑫浩、李彬、吴翠萍。T/HSPP00032022 -1-茄科植物携带凤果花叶病毒检测技术规程 1 范围 本文件规定了凤果花叶病毒的检测技术规程。本文件适用于番茄、辣椒、马铃薯等茄科植物种子及种苗中凤果花

4、叶病毒的检测和鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2964 植物病毒检测规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 凤果花叶病毒分类信息 中文名：凤果花叶病毒 学名：Pepino mosaic virus 类病毒名及缩写：pepino mosaic virus，PepMV 分类地位：属芜菁黄花叶病毒目（Tymovirales），甲型线状病毒科（Alp

5、haflexiviridae），马铃薯 X 病毒属（Potexvirus）。凤果花叶病毒的基本信息参见附录A。5 仪器和试剂 仪器设备 电子天平（感量0.001 g）、植物培养箱、研钵、高压灭菌锅、纯水仪、PH仪、旋涡振荡器、高速冷冻离心机、台式小型离心机、恒温加热器、生物安全柜、制冰机、普通PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、杂交炉、交联仪、杂交管、化学发光检测仪、各种量程的可调配移液器（2.5 L，10 L、20 L，200 L，1000 L）、常规冰箱、超低温冰箱等。主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。商品化Trizol试剂、三

6、氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、反转录酶、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸、PCR缓冲液、引物和探针、Tris-乙酸电泳缓冲液，硝酸银溶液等。核酸提取相关试剂符合附录B的要求；分子杂交试剂应符合附录C的要求。6 流程图 凤果花叶病毒检测流程图见附录D。检测过程中防扩散、防污染的措施按照SN/T 2964中的规定执行。7 检测方法T/HSPP00032022 -2-样品制备 7.1.1 种子类 每份送检样本中选取100200粒种子，表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中，2025、12 h/12 h光暗交替条件下保湿培养直至萌发。随机抽取叶片1 g5 g，置于去RNA酶的研钵中，加入液氮后迅速研磨成

7、细粉状，制成检测样品。7.1.2 种苗类 对于有症状的种苗类样品，选取全部表现症状的叶片；对于无症状的种苗类样品，随机选取。取100 g200 g叶片置于去RNA酶的研钵中，加入液氮后迅速研磨成细粉状，制成检测样品。RNA 提取 取制备好的检测样品100 mg，按照常规Trizol法提进行总RNA提取；以感染PepMV的茄科植物样本作为阳性对照，以无PepMV茄科植物样本作为阴性对照，同时进行提取。具体操作步骤参见附录B。核酸提取也可选择相应商业化试剂盒。RT-PCR 检测 7.3.1 cDNA 合成 0.2 mL PCR管中加入DEPC处理去离子水10 L、模板RNA 3 L（50 ng20

8、0 ng），随机引物1 L，95（或沸水）水浴7 min，迅速置冰上冷却3 min；然后加5 反转录缓冲液4 L、10 mmol/L dNTPs、40 U/L RNAase抑制剂（Rnasin）0.5 L、200 U/L 反转录酶（M-MLV）0.5 L，混匀后37水浴1 h；反转录结束后瞬时离心，95（或沸水）水浴5 min，冰浴3 min，直接进行PCR扩增。cDNA合成也可采用相应商业化试剂盒。7.3.2 PCR 扩增 反应体系：0.2 mL PCR管中加入10 PCR buffer（含Mg2+）2.5 L，dNTPs（10 mmol/L）2 L，引物（均为10 mol/L）各1.0 L

9、（见表1），5 U/L Taq酶0.5 L，模板cDNA3 L，加DEPC处理水至总体积25 L。每个样品设置两个平行反应，以双蒸水代替模板作为空白对照。表 1 PCR反应特异性引物及序列 引物名称 引物序列（5-3）产物大小（bp）PepMV352F GCACTTTACCRCATTATGTCT 352 PepMV352R CTTTATGHACAGCAGCTCTTC 反应程序：95 5 min；95 30 s，56 30 s，72 30 s，35个循环；72 10 min。也可采用一步法RT-PCR商业化试剂盒，反应体系和反应条件可根据说明书进行适当调整。7.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测 制备1

10、.5%琼脂糖凝胶，取1 L加样缓冲液与5 LRT-PCR反应产物混匀进行点样，采用110V电泳35 min后，凝胶成像检测扩增产物。7.3.4 测序分析（可选）对RT-PCR扩增产物进行测序，将测得序列与GenBank数据库中已知的PepMV序列进行相似性比对分析，验证样品检测结果。分子杂交 采用Roche地高辛标记试剂盒进行核酸探针标记，制备地高辛标记的PepMV RNA探针，放置于-20备用。取3 L样品核酸，经变性后点于带正电荷的尼龙膜上，晾干后在交联仪上交联3 min。交联固定后的尼龙膜在杂交炉上68进行预杂交1 h，然后加入2 LRNA探针杂交10 h。杂交后进行洗膜，最后按照化学发

11、光法进行杂交检测。具体操作步骤参见附录C。T/HSPP00032022 -3-结果判定 对照成立的前提下，检测结果按照以下原则进行判定：样品RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阳性，可判定样品中携带有凤果花叶病毒；样品RT-PCR检测或分子杂交检测结果为阳性，经测序分析验证与已知的PepMV序列相似性达90%以上，可判断样品携带凤果花叶病毒；样品RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阴性，可判定样品未携带凤果花叶病毒。8 留样保存与结果记录 留样保存 检出凤果花叶病毒的种子、生长苗木样品以及7.1剩余制样于-80冰箱内保存。样品应保存至少6个月。保存期满后，应经高压灭菌后方可处理。结果记录

12、RT-PCR检测结果电泳照片、分子杂交检测结果照片、测序报告和序列分析结果图应一并保存。建档 建立实完整的实验档案，包括样品的来源、种类、时间，试验的时间、地点、方法、结果及实验人员签字等。-4-A A 附 录 A（资料性附录）凤果花叶病毒基本信息 A.1 寄主范围 1980年，Jones首次从秘鲁海岸卡内特河谷种植的凤果（Solanum muricatum）中分离到凤果花叶病毒。PepMV病毒的自然寄主范围较窄，主要是番茄、马铃薯、茄子等茄属植物；实验寄主包括茄属之外的烟草、辣椒等茄科植物。A.2 地理分布 广泛分布于欧洲、南美洲、北美洲，以及非洲和亚洲的几个国家。在我国仅局部地区有发生报道

13、。欧洲：奥地利、比利时、保加利亚、克罗地亚、塞浦路斯、捷克、丹麦、法国、德国、希腊、意大利、荷兰、英国、西班牙、瑞士、瑞典、乌克 兰、葡萄牙、芬兰、匈牙利、爱尔兰、立陶宛、马耳他、挪威、波兰、斯洛伐克、斯洛文尼亚、土耳其等。南美洲：智利、秘鲁、厄瓜多尔等。北美洲：加拿大、美国、墨西哥。非洲：马达加斯加、摩洛哥、南非、埃及。亚洲：以色列、叙利亚及中国上海、云南。A.3 传播途径 PepMV 长距离传播主要通过受感染的种子和苗木。PepMV不侵染胚和胚乳，仅侵染种皮。在番茄种子上，该病毒是通过种传方式传播，而不是种子传递方式传播，但PepMV种传率较低，为0.005%0.057%，使用被感染的种子

14、有传播风险。PepMV具有高度的接触传染性，容易通过机械接种传播，如污染的工具、鞋、衣服、手与植株摩擦，以及收割、嫁接等农事操作。其通过机械传染的传播速率比其他已知的马铃薯 X 病毒属的病毒传播更快，如番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）。PepMV还可通过花粉可附着在大黄蜂（Bombus impatiens）身体上传播，也可通过土壤生息绝对寄生菌孢子（Olpidium virulentus）传播危害。A.4 病害症状 番茄受该病毒侵染后，症状由潜隐至明显，表现差异较大。果实变色，如大理石花纹、火焰纹是最为典型的

15、症状；有时也出现果实开裂、畸形。叶片症状有褪绿、黄色花叶、荨麻头、泡状、褪色花叶、黄色角状叶斑、叶坏死。茎表现坏死症状。但不是全部被PepMV侵染的植物都表现症状，随着环境温度升高，症状变得不明显，随着叶片成熟，症状逐渐消失。无论PepMV症状如何变化，苗期地上和地下部分生长活跃期前一个月，均可检测到PepMV病毒核酸。人工接种实验中，被接种PepMV的番茄产量减少不大，但是果实品质下降，果实直径缩小，一级果率仅为健康对照组的38%。A.5 PepMV基因组特征 -5-PepMV基因组为正义单链RNA，大小约为6410 bp，包含5个开放阅读框。ORF1编码RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）

16、，分子量为164 kDa，具有甲基化酶、NTP结合和聚合酶基序的功能；ORF2 至 ORF4编码的蛋白分子量大小分别为26 kDa、14 kDa和9 kDa；ORF5编码衣壳蛋白，分子量为25 kDa。此外，PepMV基因组还具有两个短的非翻译区，3末端有poly（A）尾结构。PepMV基因组结构符合马铃薯X病毒属成员的典型特征。根据核苷酸序列和生物学特性，凤果花叶病毒可分为 6个株系，分别是欧洲株系（EU）、北美株系（US1）、智利株系（CH2）、重组株系（US2）、原始秘鲁株系（LP）和新秘鲁株系（PES）。起初在欧洲番茄上发生的PepMV以LP株系为主；自2004年起，CH2株系发生率逐

17、步上升。EU、LP、CH2 和US1等4个株系的核苷酸序列之间的同源率为78%95%。-6-附 录 B（资料性附录）核酸提取方法 B.1 核酸提取相关试剂 DEPC处理超纯水：取制备好的去离子水500 mL，加入500 L DEPC摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）：称取12.11 g Trisbase，加50 mL DEPC处理超纯水溶解，用浓HCl调pH值至8.0，定容至100 mL，高温高压灭菌后室温保存；0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）：称取18.61 g Na2EDTA2H2O，加80 mL处理超纯水溶解，用约2 g N

18、aOH调pH 值至8.0，加DEPC 100 L，定容至100 mL，摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；10TE（pH8.0）：取1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10 mL和0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）2 mL，加50 mL DEPC处理超纯水溶解，定容至100 mL，高温高压灭菌后室温保存；B.2 核酸提取 称取7.1制备的检测样品100 mg，转入已灭菌的去RNA酶离心管；立即加入1 mL Trizol，涡旋振荡15 s，室温静置15 min；加400 L氯仿，上下颠倒混匀，室温静置2 min，4 12000 r/m离心15 min；取上清于新的离心管中

19、，加无加入等体积的异丙醇沉淀，轻微颠倒，-20沉降1h；12000 r/m离心15 min；弃上清，沉淀中加1 mL 预冷的75%酒精，上下颠倒10次，12000 r/m离心5 min，弃上清；瞬间离心20 s，吸去多余液体，室温干燥5-10 min，加30 L DEPC处理的去离子水溶解，-80 冰箱保存备用。也可选择市售商品化提取试剂盒进行核酸提取。-7-附 录 C（参考性附录）分子杂交方法 C.1试剂与材料 C.1.1核酸杂交相关试剂 20SSC：称取 175.3 g NaCl，88.2 g 柠檬酸钠2H2O，溶解于 800 mL 去离子水，用 HCl调 pH 值至 7.0，最后用定容至

20、 1 L，高温高压灭菌后室温保存；50Denhardts 溶液：称取 1 g Ficoll 400，1 g PVP-40，1 g BSA，溶解于 80 mL 去离子水，定容至 100 mL，过滤除菌及杂质后-20 贮存；预杂交液：6 SSC、5 Denhardt 溶液、50%(w/v)Formamide、0.5%(w/v)SDS、100 g/mL 鲑鱼精 DNA（用前加热变性后加入）；杂交液：预杂交液中加入 DIG-RNA 探针，稀释成适当浓度；封闭液：将 0.73 g NaCl，0.24 g Na2HPO4，0.1 g NaH2PO4，5 g SDS 溶于 80 mL 水中，定容至 100

21、mL，过滤除菌后室温保存；洗涤液 I：为 1/10 稀释的封闭液；洗涤液 II：将 0.24 g Trisbase，1.16 g NaCl，0.4 g MgCl2溶于 160 mL 水中，用 HCl 调pH 至 9.5，定容至 200 mL，过滤除菌后室温保存；MOPS 缓冲液（10）:200 mmol/L MOPS(pH7.0)、50 mmol/L NaAc、10 mmol/L EDTA；Maleic acid 缓冲液：100 mmol Maleic acid、150 mmol NaCl，pH7.5；洗膜缓冲液：100 mmol Maleic acid、150 mmol NaCl、0.3%(

22、v/v)Tween20，pH7.5；检测缓冲液：100 mmol Tris-HCl(pH9.5)、100 mmol NaCl；抗地高辛的酶标抗体：Anti-DIG-AP；CSPD：25 mmol CSPD（用前稀释）；带正电的尼龙膜为 Amersham Pharmacia Biotech 公司的产品。C.2 标记探针 挑取PepMV目标片段正向插入的克隆质粒，用Nde 对质粒进行酶切线性化处理，获得含有目标片段的线性化重组质粒。采用 T7 RNA 多聚酶进行体外转录随机标记单链RNA探针：取1 g线性化质粒，加入4 L 5转录反应缓冲液、2 L地高辛（digoxin，DIG）标记dNTPs和2

23、 L T7 RNA聚合酶、0.5 L RNA酶抑制剂，37标记反应2 h，反应完成后保存于-20冰箱备用。C.3 实验步骤 C.3.1 样品RNA的提取 方法同B.2。C.3.2 RNA斑点印迹杂交 -8-1）取 3 L RNA 加 7L 变性缓冲液(33%甲醛、50%去离子甲酰胺和 1 MOPS)，65水浴 15 min，冰浴 5 min，促使核酸变性；2)然后取变性核酸点于带正电荷的尼龙膜上，每次 3 L，点好后将膜晾干；3）将膜正面朝上置于胶联仪（Hoefer-Uvc500，Amersham Biosciences Corp.）内，在紫外光强度 1200100 J/cm2条件下胶联固定

24、3 min；4）将膜用 6SSC 预湿后，放入预杂交液中，在杂交炉（Fisher Scientific International Inc.）68预杂交 1 h；5）然后将探针煮沸 5 min，迅速冰上冷却 5 min，加入到杂交缓冲液中，65杂交 10 h；6）杂交结束后，将膜取出，用 20 mL40 mL 含 2SSC 和 0.1%SDS 溶液在室温洗膜 5 min，重复一次；7）用 20 mL40 mL 含 0.1SSC 和 0.1%SDS 溶液在 68 下洗膜 15 min，重复一次；8）将膜放入杂交袋中用于检测。C.3.3 杂交检测 采用 Roche 地高辛检测试剂盒在室温（2025

25、）条件下进行杂交结果的检测。按 100 cm2膜面积计算试剂用量。1）洗膜后，用洗液冲洗杂交膜；将膜放入在 100 mL 封闭液内封闭 30 min；2）利用封闭液按 1：10000 稀释抗体，将膜放入 20 mL 抗体溶液内孵育 20 min；3）加 100 mL 洗膜液，室温洗膜 15 min，重复 1 次；4）加 20 mL 检测液，室温孵育 2 min5 min，重复 1 次；5）杂交面朝上，加 2 mL CSPD 使其均匀铺在膜上，室温孵育 5 min，取出膜沥干溶液，用保鲜膜包好；6）5 min15 min 后置于化学发光检测仪内检测光信号。C.4 结果判定 阴性对照无或弱的杂交信号，阳性对照有强的杂交信号，则结果可靠；杂交信号显著比阴性对照强的判定为阳性样品。-9-附 录 D（规范性性附录）凤果花叶病毒检测流程图 D.1 凤果花叶病毒检测流程图 图D.1 凤果花叶病毒检测流程图 与 GenBank 数据库中已知的 TASVd 序列进行相似性比对分析，相似性达 90%以上 检出凤果花叶病毒 检测样品 RT-PCR 检测和分子杂交检测 阳性检测 阳性检测 测序分析验证 RT-PCR 检测或分子杂交检测 检出凤果花叶病毒