BJS201805食品中那非类物质的测定.doc
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1、 1 附件 食品中那非类物质的测定 （BJS 201805）1 1 范围范围本标准规定了食品（含保健食品）基质中 90 种那非类物质的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。标准中方法一超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中 90 种那非类物质的定性和定量测定。标准中方法二超高效液相色谱-串联高分辨质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中 90 种那非类物质的筛查和定性确证。 方法一方法一 超高
2、效液相色谱超高效液相色谱- -三重四极杆串联质谱法三重四极杆串联质谱法2 2 原理原理试样经甲醇超声提取，过滤后，滤液供超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪测定，外标法定量。3 3 试剂和材料试剂和材料注：水为GB/T 6682规定的一级水。3.13.1 试剂试剂3.1.1 甲醇（CH3OH）：质谱级。3.1.2 甲酸（HCOOH）：质谱级。3.1.3 乙酸乙酯（C4H8O2）：分析纯。3.1.4 盐酸（HCl）：分析纯。3.23.2 试剂配制试剂配制3.2.1 0.1%甲酸水溶液：取甲酸 1mL 用水稀释至 1000mL，用滤膜（4.3）过滤后备用。3.2.2 盐酸甲醇溶液（1+99）：取盐酸
3、 1mL 用甲醇稀释至 100mL。3.2.3 甲醇水溶液（1+1）：将甲醇与水等体积混合。3.33.3 标准品标准品西地那非等 90 种物质标准品的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量见附录 A 表 A.1，纯度98%。3.43.4 标准溶液配制标准溶液配制3.4.1 标准储备液（200 g/mL）：分别精密称取 Lodenafil carbonate（46 罗地那非碳酸酯）、 2 Sildenafil dimer impurity（63 西地那非二聚体杂质）、Vardenafil dimer（69 伐地那非二聚体）标准品（3.3）各 10mg，用盐酸甲醇溶液（1+99）溶
4、解并稀释至 50mL，摇匀；分别精密称取其余87 种标准品（3.3）各 10 mg，用甲醇溶解并稀释至 50mL，摇匀，制成浓度为 200 g/mL 标准储备液。-20 避光贮存，有效期 3 个月。 3.4.2 混合标准中间工作溶液（1 g/mL）：分别准确吸取标准储备液（200 g/mL） （3.4.1）各0.1 mL， 用甲醇稀释至 20mL，摇匀，制成 1 g/mL 的混合标准工作溶液。临用新制。根据化合物保留时间适当分组。3.4.3 混合标准工作溶液：分别准确吸取混合标准中间工作液（1 g/mL） （3.4.2）适量，用甲醇水溶液（1+1） （3.2.3）稀释，摇匀，作为系列混合标准工
5、作溶液 ，浓度依次为各化合物 2 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、50 g/L，临用新制或依仪器响应情况配制适当浓度的混合标准工作溶液。或根据需要采用空白基质提取液（5.1.4） ，配制适当浓度的基质混合标准工作溶液。4 4 仪器和设备仪器和设备4.1 高效液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾（ESI）离子源。4.2 天平：感量分别为 0.01 mg 和 0.1 mg。4.3 微孔滤膜：0.22m，有机相型。4.4 离心机：转速4 000 r/min。4.5 超声波清洗器。5 5 分析步骤分析步骤5.15.1 试样制备试样制备5.1.15.1.1 固态或半固态试样固态或半固态试样取固
6、态试样（蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、咖啡及含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊等剂型）适量混匀，研细，或取半固态试样（果冻）适量混匀，精密称取 1g（精确至 0.001 g）置于 50 mL 容量瓶中，加甲醇（3.1.1）适量，超声提取 15 min，放冷至室温，用甲醇（3.1.1）定容，转移至 50 mL 离心管中，4 000 r/min 离心 5 min，上清液经微孔滤膜过滤（4.3） ，取续滤液，根据实际浓度用甲醇水溶液（1+1） （3.2.3）适当稀释至线性范围内，备用。5.1.25.1.2 液态试样液态试样取试样（饮料、酒）适量摇匀，准确吸取 1mL 置于 50 mL 容量瓶中，加
7、甲醇（3.1.1）适量，超声提取 15 min，放冷至室温，用甲醇（3.1.1）定容，经微孔滤膜（4.3）过滤，取续滤液，根据实际浓度用甲醇水溶液（1+1） （3.2.3）适当稀释至线性范围内，备用。5.1.35.1.3 油脂基质（软胶囊）试样油脂基质（软胶囊）试样取试样（软胶囊）适量混匀，精密称取 1g（精确至 0.001 g）置于 50 mL 容量瓶中，加乙酸乙酯 5mL，振摇，使其分散，加甲醇（3.1.1）适量，超声提取 15 min，放冷至室温，用甲醇 3 （3.1.1）定容，转移至 50 mL 离心管中，4 000 r/min 离心 5 min，上清液经微孔滤膜过滤（4.3） ，取续
8、滤液，根据实际浓度用甲醇水溶液（1+1） （3.2.3）适当稀释至线性范围内，备用。5.1.45.1.4 空白基质提取液空白基质提取液称取空白试样适量，与 试样同法处理，制得空白基质提取液。5.1.55.1.5 空白溶液空白溶液不加试样，与试样同法处理，制得空白溶液。5.25.2 仪器参考条件仪器参考条件5.2.15.2.1 色谱条件色谱条件a）色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 （3.0150 mm， 1.8 m） ，或性能相当者。b）流动相：A 为 0.1%甲酸水溶液（3.2.1） ，B 为甲醇（3.1.1） ，梯度洗脱程序见表 1。c）流速：400 L/min。d）
9、柱温：35。e）进样量：5 L。表 1 梯度洗脱程序表梯度时间/min流动相 A/%流动相 B/%0901015050163565192982229822.190102590105.2.25.2.2 质谱条件质谱条件a） 离子源：电喷雾离子源（ESI 源） 。b） 检测方式：多反应离子监测（MRM） 。c） 碰撞气为高纯氮气，干燥气、雾化气、鞘气等均为氮气或其他合适气体，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，毛细管电压、干燥气温度、鞘气温度、鞘气流量、喷嘴电压、碰撞能量、碎裂电压等参数应优化至最佳灵敏度，监测离子对和定量离子对等信息详见附录 B。5.35.3 定性测定定性测定按照超高效
10、液相色谱-三重四极杆串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，当试样中检出与某标准品色谱峰保留时间一致的色谱峰（变化范围在2.5%之内） ，并且试样色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比（k）的偏差不超过表 2 规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。 4 表 2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（%）k50%50%k20%20%k10%k10% 允许的最大偏差（%） 20 25 30 50 5.45.4 定量测定定量测定5.4.15.4.1 标准曲线的制作标准曲线的制作将混合标准工作溶液（3.4.3）分
11、别按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，以定量离子的色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.4.25.4.2 试样溶液的测定试样溶液的测定将试样溶液（5.1.1-5.1.3）按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到样品溶液中对应组分的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。对照品色谱图参见附录 D。5.4.35.4.3 空白溶液的测定空白溶液的测定空白溶液（5.1.5） 同试样溶液测定步骤操作。6 6 结果计算结果计算将液相色谱-质谱测得浓度代入下式计算含量：（1）fmVcX1000式中：X 试样中各
12、待测物的含量，单位为毫克每千克 或毫克每升（mg/kg 或 mg/L） ；c 从标准曲线中读出的 供试品溶液中各待测物的浓度，单位为微克每升（ g/L） ；V 样液最终定容体积，单位为毫升（ mL） ；m 试样溶液所代表的质量，单位为克（g 或 L） ；f 稀释倍数。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。7 7 精密度精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 20%。8 8 其他其他当称样量为 1 g（精确至 0.001g）或 1mL，定容体积为 50mL 时，本方法中 90 种那非类物质的检出限均为为 0.051m
13、g/kg 或 0.050.25 mg /L，定量限为 0.12.5mg/kg 或 0.10. 5mg /L。详见附录 C 表 C.1。空白试验应无干扰。 5 方法二方法二 超高效液相色谱超高效液相色谱- -串联高分辨质谱法串联高分辨质谱法2 原理原理试样经甲醇超声提取，过滤后，滤液供高效液相色谱-串联高分辨质谱测定，比较供试品与标准品的保留时间、一级质谱图和二级质谱图进行筛查和定性确证。3 试剂和材料试剂和材料注：水为GB/T 6682规定的一级水。3.1 试剂试剂3.1.1 乙腈（C2H3N）：质谱级。3.1.2 甲酸（HCOOH）：质谱级。3.1.3 甲醇（CH3OH）：分析纯。3.1.4
14、 乙酸乙酯（C4H8O2）：分析纯。3.1.5 盐酸（HCl）：分析纯。3.2 试剂配制试剂配制3.2.1 0.1%甲酸水溶液：取甲酸 1mL 用水稀释至 1000mL，用滤膜（4.3）过滤后备用。3.3 标准品标准品同方法一 3.3 标准品项下。3.4 标准溶液配制标准溶液配制3.4.1 标准储备液（200 g/mL）：同方法一 3.4.1 标准储备液项下。3.4.2 混合标准工作溶液（1 g/mL）：同方法一 3.4.2 混合标准中间工作溶液项下。或依仪器响应情况配制至适当浓度。根据化合物保留时间和仪器扫描速度适当分组。4 仪器和设备仪器和设备4.1 高效液相色谱-串联高分辨质谱仪，配有电
15、喷雾（ESI）离子源。4.2 天平：感量分别为 0.1 mg 和 1 mg。4.3 滤膜：0.22m，有机相型。4.4 超声波发生器。5 5 分析步骤分析步骤5.15.1 试样制备试样制备 6 5.1.15.1.1 试样处理试样处理同方法一试样制备 5.1.15.1.3 项下，根据实际浓度适当稀释，备用。5.1.25.1.2 空白溶液制备空白溶液制备同方法一空白溶液制备 5.1.5 项下。5.25.2 仪器参考条件仪器参考条件5.2.15.2.1 色谱条件色谱条件a）色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18 （3.075 mm， 2.7m） ，或性能相当者。b）流动相：
16、A 为 0.1%甲酸水溶液（3.2.1） ，B 为乙腈（3.1.1） ，梯度洗脱程序见表 3。c）流速：0.4mL/min。d）柱温：30。e）进样量：1L。表 3 梯度洗脱程序表梯度时间/min流动相 A/%流动相 B/%0955152981729817.5955209555.2.25.2.2 质谱条件质谱条件a）离子源：电喷雾离子源（ESI 源） 。b）干燥气、雾化气、鞘气、碰撞气等均为高纯氮气或其他合适气体，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，毛细管电压、干燥气温度、鞘气温度、鞘气流量、喷嘴电压、碰撞能量、碎裂电压等参数应优化至最佳灵敏度，母离子及碎片离子等参考信息详见附录 E
17、 表 E.1。6 6 定性判定定性判定按照超高效人液相色谱-串联高分辨质谱条件测定试样（5.1.1）和混合标准工作溶液（3.4.2） ，记录试样和混合标准工作溶液中各化合物的色谱峰保留时间及多级质谱图，当试样中检出与某标准品色谱峰（或由标准品建立的谱库）保留时间一致的色谱峰，并且与标准品母离子精确分子量误差不超过百万分之五，主要碎片离子精确分子量误差不超过百万分之十，即可以确定试样中检出相应化合物。7 7 检测方法的灵敏度和专属性检测方法的灵敏度和专属性7.17.1 灵敏度灵敏度当取样量为 1 g 或 1 mL，定容体积为 50 mL 时，本方法中 90 种化合物的检出限为 7 0.170mg
18、/kg 或 0.150mg/L，详见附录 F 表 F.1。7.27.2 专属性专属性取空白溶液（5.1.2）进样测定，应无干扰。取混合标准工作溶液（3.4.2）进样测定，各化合物之间应无互相干扰，同分异构体应可通过保留时间或二级质谱图进行区分。 8 附录 A西地那非等 90 种化合物相关信息表表A.1 90种种化化合合物物英英文文名名称称、中中文文名名称称、分分子子式式、 CAS号号、相相对对分分子子质质量量序号英文名中文名分子式CAS 号分子量1Sildenafil西地那非C22H30N6O4S139755-83-2474.62Tadalafil他达拉非C22H19N3O4171596-29
19、-5389.43Imidazosagatriazinone脱硫伐地那非C17H20N4O2139756-21-1312.44Gendenafil庆地那非C19H22N4O3147676-66-2354.45Acetil acid那非乙酰酸C18H20N4O4147676-78-6356.46Xanthoanthrafil苯酰胺那非C19H23N3O61020251-53-9389.47Aminotadalafil氨基他达拉非C21H18N4O4385769-84-6390.48Chloropretadalafil他达拉非甲基氯化物C22H19ClN2O5171489-59-1426.89Pip
20、eriacetildenafil苯噻啶红地那非C24H31N5O3147676-50-4437.510Noracetildenafil那红地那非C24H32N6O3949091-38-7452.511Carbodenafil卡巴地那非C24H32N6O3944241-52-5452.512Pseudovardenafil伪伐地那非C22H29N5O4S224788-34-5459.613Norneosildenafil那莫西地那非C22H29N5O4S371959-09-0459.614N-DesethylvardenafilN-去乙基伐地那非C21H28N6O4S448184-46-1460
21、.615N-DesmethylsildenafilN-去甲基西地那非C21H28N6O4S139755-82-1460.616Acetildenafil红地那非C25H34N6O3831217-01-7466.617Hydroxyacetildenafil羟基红地那非C25H34N6O4147676-56-0482.618Avanafil阿伐那非C23H26ClN7O3330784-47-9484.019Aildenafil艾地那非C23H32N6O4S496835-35-9488.620Homosildenafil豪莫西地那非C23H32N6O4S642928-07-2488.621Vard
22、enafil伐地那非C23H32N6O4S224785-90-4488.622Thiosildenafil硫代西地那非C22H30N6O3S2479073-79-5490.623Thiohomosildenafil硫代豪莫西地那非C23H32N6O3S2479073-80-8504.724Hydroxyvardenafil羟基伐地那非C23H32N6O5S224785-98-2504.625Hydroxyhomosildenafil羟基豪莫西地那非C23H32N6O5S139755-85-4504.626Udenafil乌地那非C25H36N6O4S268203-93-6516.727Hydr
23、oxythiohomosildenafil羟基硫代豪莫西地那非C23H32N6O4S2479073-82-0520.728Norneovardenafil那莫伐地那非C18H20N4O4358390-39-3356.429Nitrodenafil硝地那非C17H19N5O4147676-99-1357.430Nortadalafil去甲基他达拉非C21H17N3O4171596-36-4375.431Chlorodenafil氯地那非C19H21ClN4O31058653-74-9388.8 9 序号英文名中文名分子式CAS 号分子量32Hydroxychlorodenafil羟基氯地那非C1
24、9H23ClN4O31391054-00-4390.933N-ButyltadalafilN-丁基他达拉非C25H25N3O4171596-31-9431.534Desmethylcarbodenafil去甲基卡巴地那非C23H30N6O3147676-79-7438.535Descarbonsildenafil去碳西地那非C21H30N6O4S1393816-99-3462.636Dimethylacetildenafil二甲基红地那非C25H34N6O31290041-88-1466.637Dithio-desmethylcarbodenafil二硫代去甲基卡巴地那非C23H30N6OS2
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