接种分离纯化和培养技术.ppt

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1、接种分离接种分离纯化和培养技化和培养技术第一节第一节 培养基制备技术培养基制备技术第二节第二节 接种、分离纯化和培接种、分离纯化和培养技术养技术第三节第三节 常用的微生物培养基常用的微生物培养基原理、制作和现原理、制作和现象（自学）象（自学）第一节第一节 培养基制备技术培养基制备技术一、玻璃器皿的清洗一、玻璃器皿的清洗在制备培养基的过程中，首先要使用一些在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的的情况，经过一定的

2、处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。能使用。二、培养基的类型二、培养基的类型在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基（Media）。由于各类微生物对营养的要求不）。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。的培养基划分为若干类型。1、根据对培养基组成

3、物质的化学成分是、根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分否完全了解来区分，可以将培养基分为为天然培养基天然培养基、合成培养基、合成培养基、半合成培养基半合成培养基。天然培养基是指利用各种动、植物或微生天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它

4、的化学成分，但一般来讲，营不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。性常受生产厂或批号等因素的影响。1）天然培养基）天然培养基 2）合成培养基）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化

5、学成分精确、重复性配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。的研究。3）半合成培养基）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。实验

6、室中使用最多。2 2、根据培养基的物理状态来区分，可以、根据培养基的物理状态来区分，可以分为：分为：固体培养基固体培养基、液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基。3、根据培养基的用途来区分，可分为：、根据培养基的用途来区分，可分为：选择培养基选择培养基、增殖培养基增殖培养基、鉴别培养基鉴别培养基等。等。三、培养基制备的基本方法和注意事项三、培养基制备的基本方法和注意事项 1、培养基配方的选定、培养基配方的选定同一种培养基的配方在不同著作中常会有同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应

7、尽量收集有格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。的，加以选用，记录其来源。2、培养基的制备记录、培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养基每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混制记录随制好的培养基一同存放

8、、以防发生混乱。乱。3、培养基成分的称取、培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。取完毕后，还应进行一次检查。4、培养基各成份的混合和溶化、培养基各成份的混合和溶化培养基所用化学药品均应是化学纯的。使培养

9、基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢加热溶化，可放入大烧杯或大好使用不锈钢加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。中蒸煮溶化。5、培养基、培养基pH的初步调正的初步调正因培养基在加热消毒过程中、因培养基在加热消毒过程中、pH会有所会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行变化，培养基各成分完全溶解后，应进行pH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低的初步调正。例如，牛

10、肉浸液约可降低 pH 0.2，而肠浸液，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终以期能掌握培养基的最终pH，保证培养基的，保证培养基的质量。质量。pH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。以利培养基沉淀物的析出。6、培养基的过滤澄清、培养基的过滤澄清液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此，须要采用过滤或其应透明无显著沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般

11、液体培养基它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷

12、却至即将冷却至5560的培养基放入大的三角烧的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每，每1000ml培养基加入培养基加入12个鸡蛋的蛋白，强力振个鸡蛋的蛋白，强力振摇摇35分钟，置高压蒸汽灭菌器中、分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121加热加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。分钟、取出趁热以绒布过滤即可。7、培养基的分装、培养基的分装培养基的分装，应按使用的目的和要求，培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿。容器

13、口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试管一般多有用螺旋盖者）。分装时最好能使用管一般多有用螺旋盖者）。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成养基时，分装量应以能形成2/3底层和底层和1/3斜面斜面的量为洽当。的量为洽当。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以

14、为测定该批培养基最终培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。之用。8、培养基的灭菌、培养基的灭菌一般培养基可采用一般培养基可采用121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配成某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗培养基亦应用较低温度灭菌。血

15、液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约却约50左右的培养基中。左右的培养基中。琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至至55-60时，摆置成适当斜面，待其自然凝时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。固。9、培养基的质量测试、培养基的质量测试每批培养基制备好以后，应仔细检查一每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终其最终pH。将全部培养基放入将全部培养基放入3

16、61恒温箱培养过恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。夜，如发现有菌生长，即弃去。用有关的标准菌株接种用有关的标准菌株接种12管或瓶培养基，管或瓶培养基，培养培养2448小时，如无菌生长或生长不好。应小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。该批培养基即应弃去，不能使用。10、培养基的保存、培养基的保存培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过培养基不宜超过3天。每批培养基

17、均必须附有该天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。批培养基制备记录副页或明显标签。第二节第二节 接种、分离纯化和培养技术接种、分离纯化和培养技术一、接种一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做养基上或活的生物体内的过程叫做接种接种。1、接种工具和方法、接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之

18、分。有时滴管、吸管也可作有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。接种和分离工具接种和分离工具1.接种针接种针 2.接种环接种环 3.接种钩接种钩 4.5.玻璃涂玻璃涂棒棒 6.接种圈接种圈 7.接种锄接种锄 8.小解剖刀小解剖刀常用的接种方法有以下几种：常用的接种方法有以下几种：1）划线接种）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种基表面作来回直线形的移动，就可达到接种

19、的作用。常用的接种工具有接种环，接种针的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。2）三点接种）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。进行接种的。3）穿刺接种）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常在保藏厌氧菌种或研究微生物的

20、动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。4）浇混接种）浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至然后再倒入冷却至45左右的固体培养基，迅左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达

21、到稀释的目的。待速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。单个的微生物菌落。5）涂布接种）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。6）液体接种）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中

22、，或者从液体培养物中，用移液管将菌液基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。移至固体培养基中，都可称为液体接种。7）注射接种）注射接种 该法是用注射的方法将待接的微生物转接该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。来预防某些疾病。8）活体接种）活体接种 活体接种是专门用于培养病毒或其它病原活体接种是专门用于培养病

23、毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。也可以是拌料喂养。2、无菌操作、无菌操作培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培含菌材料（如样品、菌苔或

24、菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。验室检验中的各种接种必须是无菌操作。实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂

25、进清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。斜面接种时的无菌操作斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌接种灭菌 (2)开启棉塞开启棉塞 (3)管口灭管口灭菌菌(4)挑起菌苔挑起菌苔 (5)接种接种 (6)塞好棉塞塞好棉塞 二、分离纯化二、分离纯化含有一种以上的微生物培养物称为混和培含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（称为纯培养（Pure cultur

26、e）。在进行菌种鉴）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。种。1、倾注平板法、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在量的稀释液与熔化好的保持在4050左右的营左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个恒箱中

27、培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。便可得到纯培养物。2、涂布平板法、涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。到单个菌落。1、倾注平板法、倾注平板法2、涂布平板法、涂布平板法操作较麻烦，操作较麻烦，对

28、好氧菌、热对好氧菌、热敏感菌效果不敏感菌效果不好！好！使用较多的常规使用较多的常规方法，但有时涂方法，但有时涂布不均匀！布不均匀！3、平板划线法、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，四格法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀

29、释，最后在所划的线上分接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。落。平板划线分离法平板划线分离法1.斜线法斜线法 2.曲线法曲线法 3.方格法方格法 4.放射放射法法 5.四格法四格法三、培养三、培养微生物的生长，除了受本身的遗传特性决微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、等。微生物的浓度、温度、水分、氧气、等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。2、培养方法

30、、培养方法1）根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养）根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。和厌氧培养两大类。好氧培养好氧培养：也称：也称“好气培养好气培养”。就是说这。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。不断地进入瓶中。厌氧培养厌氧培养：也称：也称“厌气培养厌气培养”。这

31、类微生。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法：培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法：a.降低培养基中的氧化还原电位降低培养基中的氧化还原电位：常将还：常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。可适合厌氧菌的生长。

32、b.化合去氧化合去氧：这也有很多方法，主要有：这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。的方法除氧。c.隔绝阻氧隔绝阻氧：深层液体培养；用石蜡油封：深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。存；半固体穿刺培养。d.替代驱氧替代驱氧：用二氧气碳驱代氧气；用氮：用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气

33、；用混和气体驱代氧气。气；用混和气体驱代氧气。第三节第三节 常用的微生物培养基常用的微生物培养基原理、制作和现象原理、制作和现象牛肉膏牛肉膏 5g蛋白胨蛋白胨 10g氯化钠氯化钠 3g磷酸氢二钠磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)2g0.2%滇麝香草酚蓝溶液滇麝香草酚蓝溶液 12mL蒸馏水蒸馏水 1000mLpH7.41、糖发酵管、糖发酵管1）成分）成分 2）制法）制法 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，小试管内，121高压灭菌高压灭菌15min。其他各种糖发酵管可按上述成分配

34、好后，其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶分装每瓶100mL，121高压灭菌高压灭菌15 min。另。另将各种糖类分别配好将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭溶液，同时高压灭菌。将菌。将5mL糖溶液加入于糖溶液加入于100mL培养基内，培养基内，以无菌操作分装小试管。以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。应采用过滤法除菌。3）试验方法）试验方法 从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于361培养，一般观察培养，一般观察23d。迟缓反应需。迟缓反应需观察观察1430d。2、ONPG培养基

35、培养基1）成分）成分 邻硝基酚邻硝基酚D-半乳糖昔半乳糖昔(ONPG)60mg (O-Nitrophenyl-D-galactopyranoside)0.01mol/L磷酸钠缓冲液磷酸钠缓冲液(pH7.5)10mL1%蛋白胨水蛋白胨水(PH7.5)30mL2）制法）制法将将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于以过滤法除菌，分装于10mm75mm试管，每试管，每管管0.5mL，用橡皮塞塞紧。，用橡皮塞塞紧。自琼脂斜面上挑取培养物自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于满环接种，于361培养培养13h和和24h观察结果。如果观察结果。如果-半半乳糖苷酶产

36、生，则于乳糖苷酶产生，则于13h变黄色，如无此酶变黄色，如无此酶则则24h不变色。不变色。3）试验方法）试验方法 3、缓冲葡萄糖蛋白胨水、缓冲葡萄糖蛋白胨水 （MR和和VP试验用）试验用）1）成分）成分 磷酸氢二钾磷酸氢二钾 5g蛋白胨蛋白胨7g葡萄糖葡萄糖5g蒸馏水蒸馏水1000mLpH7.02）制法）制法3）甲基红）甲基红(MR)试验试验 溶化后校正溶化后校正pH，分装试管，每管，分装试管，每管1mL，121高压灭菌高压灭菌15min。自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于中，于361培养培养25d，哈夫尼亚菌则应在，哈夫尼亚菌则应在2225培养。滴

37、加甲基红试剂一滴，立即观培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：试剂配法：10mg甲基红溶于甲基红溶于30mL95%乙醇中，乙醇中，然后加入然后加入20mL蒸馏水。蒸馏水。4）V-P试验试验用琼脂培养物接种本培养基中，于用琼脂培养物接种本培养基中，于361培养培养24d。哈夫尼亚菌则应在。哈夫尼亚菌则应在2225培养。培养。加入加入6%-萘酚萘酚-乙醇溶液乙醇溶液0.5mL和和40%氢氧化氢氧化钾溶液钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，

38、性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在应放在361下培养下培养4h再进行观察。再进行观察。4、西蒙氏柠檬酸盐培养基、西蒙氏柠檬酸盐培养基1）成分）成分 氯化钠氯化钠5g硫酸镁硫酸镁(MgSO47H2O)0.2g磷酸二氢铵磷酸二氢铵1g磷酸氢二钾磷酸氢二钾1g柠檬酸钠柠檬酸钠5g琼脂琼脂20g蒸馏水蒸馏水1000mL0.2%溴麝香草酚蓝溶液溴麝香草酚蓝溶液 40mLpH6.82）制法）制法3）试验方法）试验方法 先将盐类溶解于水内，校正先将盐类溶解于水内，校正pH，再加琼脂，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，管，121高压

39、灭菌高压灭菌15min。放成斜面。放成斜面。挑取少量琼脂培养物接种，于挑取少量琼脂培养物接种，于361培养培养4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。培养基从绿色转为蓝色。5、克氏柠檬酸盐培养基、克氏柠檬酸盐培养基1）成分）成分 柠檬酸钠柠檬酸钠 3g葡萄糖葡萄糖 0.2g酵母浸膏酵母浸膏 0.5g单盐酸半胱氨酸单盐酸半胱氨酸 0.1g磷酸二氢钾磷酸二氢钾 1g氯化钠氯化钠 5g0.2%酚红溶液酚红溶液6mL琼脂琼脂 15g蒸馏水蒸馏水 1000mL2）制法）制法3）试验方法）试验方法 加热溶解，分装试管，加热溶解，分装试管，12

40、1高压灭菌高压灭菌15min。放成斜面。放成斜面。用琼脂培养物接种整个斜面，在用琼脂培养物接种整个斜面，在361培培养养7d，每天观察结果。阳性者培养基变为红，每天观察结果。阳性者培养基变为红色。色。6、丙二酸钠培养基、丙二酸钠培养基 1）成分）成分 酵母浸膏酵母浸膏 1g硫酸铵硫酸铵 2g磷酸氢二钾磷酸氢二钾 0.6g磷酸二氢钾磷酸二氢钾 0.4g氯化钠氯化钠 2g丙二酸钠丙二酸钠 3g0.2%溴麝香草酚蓝溶液溴麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水蒸馏水 1000mLpH6.82）制法）制法3）试验方法）试验方法 先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再后再加入指示剂

41、，分装试管，加入指示剂，分装试管，121高压灭菌高压灭菌15min。用新鲜的琼脂培养物接种，于用新鲜的琼脂培养物接种，于361培养培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。7、葡葡糖铵培养基、葡葡糖铵培养基 1）成分）成分 氯化钠氯化钠5g硫酸镁硫酸镁(MgSO47H2O)0.2g磷酸二氢铵磷酸二氢铵1g磷酸氢二钾磷酸氢二钾1g葡萄糖葡萄糖2g琼脂琼脂20g蒸馏水蒸馏水1000mL0.2%溴麝香草酚蓝溶液溴麝香草酚蓝溶液 40mLpH6.82）制法）制法先将盐类和糖溶解于水内，校正先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加，再加琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混

42、合均匀琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，后分装试管，121高压灭菌高压灭菌15min，放成斜，放成斜面。面。注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时不注意，塞，干热灭菌后使用。如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。有杂质污染时，易造成假阳性的结果。3）试验方法）试验方法 用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环

43、内含菌数在每一接种环内含菌数在20100之间为宜。将之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于种普通斜面一支作为对照。于361培养培养24h。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阴性者不生长，但在对照培养基上生长良好。阴性者不生长，但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。性结果。8、Hugh-Leifson培养基培养基(O/F试验用试验用)1）成分）成分 蛋白胨蛋白胨2g氯化钠氯化钠5g磷酸氢二钾磷

44、酸氢二钾 0.3g琼脂琼脂4g葡萄糖葡萄糖10g0.2%溴麝香草酚蓝溶液溴麝香草酚蓝溶液 12mL蒸馏水蒸馏水1000mLpH7.22）制法）制法将蛋白胨和盐类加水溶解后，校正将蛋白胨和盐类加水溶解后，校正pH至至7.2。加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指示剂。混匀后，分装试管，示剂。混匀后，分装试管，121高压灭菌高压灭菌15min，直立凝固备用。，直立凝固备用。3）试验方法）试验方法 从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两支培养基，其中一支于接种后滴加溶化接种两支培养基，其中一支于接种后滴加溶化的

45、的1%琼脂液于表面，高度约琼脂液于表面，高度约1cm，于，于361培培养。养。9、马尿酸钠培养基、马尿酸钠培养基 1）成分）成分 马尿酸钠马尿酸钠1g肉浸液肉浸液100mL2）制法）制法将马尿酸钠溶解于肉浸液内，分装于小试将马尿酸钠溶解于肉浸液内，分装于小试管内，并于管壁画一横线。以标志管内液面高管内，并于管壁画一横线。以标志管内液面高度，高压灭菌度，高压灭菌12120min。3）试剂）试剂 三氯化铁三氯化铁(FeCl36H2O)12g，溶于，溶于2%盐酸盐酸溶液溶液100mL中即成。中即成。4）试验方法）试验方法 用纯培养物接种，于用纯培养物接种，于42培养培养48h，观察，观察培养液是否到

46、达试管壁上记号处，如不足时，培养液是否到达试管壁上记号处，如不足时，用蒸馏水补足至原量。经离心沉淀，吸取上清用蒸馏水补足至原量。经离心沉淀，吸取上清液液0.8mL，加入三氯化铁试剂，加入三氯化铁试剂0.2mL，立即混，立即混合均匀，经合均匀，经1015min，观察结果。，观察结果。出现恒久之沉淀物为阳性。出现恒久之沉淀物为阳性。5）结果）结果 10、营养明胶、营养明胶 1）成分）成分 蛋白胨蛋白胨5g牛肉膏牛肉膏3g明胶明胶120g蒸馏水蒸馏水1000mLpH6.87.02）制法）制法加热溶解、校正至加热溶解、校正至pH7.47.6，分装小管，分装小管，121高压灭菌高压灭菌10min，取出后

47、迅速冷却，使其，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终凝固。复查最终pH应为应为6.87.0。3）试验方法）试验方法 用琼脂培养物穿刺接种，放在用琼脂培养物穿刺接种，放在2225培培养，每天观察结果，记录液化时间。或放在养，每天观察结果，记录液化时间。或放在361培养，每天取出，放冰箱内培养，每天取出，放冰箱内30min后再后再观察结果。观察结果。11、苯丙氨酸培养基、苯丙氨酸培养基 1）成分）成分 酵母浸膏酵母浸膏 3gDI-苯丙氨酸苯丙氨酸(或或L苯丙氨酸苯丙氨酸1g)2g磷酸氢二钠磷酸氢二钠 1g氯化钠氯化钠 5g琼脂琼脂 12g蒸馏水蒸馏水 1000mL2）制法）制法3）试验方法）试验方法

48、 加热溶解后分装试管，加热溶解后分装试管，121高压灭菌高压灭菌15min，使成斜面。，使成斜面。自琼脂斜面上挑取大量培养物，移种于苯自琼脂斜面上挑取大量培养物，移种于苯丙氨酸琼脂，在丙氨酸琼脂，在361培养培养4h或或1824h。滴。滴加加10%三氯化铁溶液三氯化铁溶液23滴，自斜面培养物上滴，自斜面培养物上流下，苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈深绿色。流下，苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈深绿色。12、氨基酸脱羧酶试验培养基、氨基酸脱羧酶试验培养基 1）成分）成分 蛋白胨蛋白胨5g酵母浸膏酵母浸膏3g葡萄糖葡萄糖1g蒸馏水蒸馏水1000mL1.6%滇甲酚紫滇甲酚紫-乙醇溶液乙醇溶液 1mLL-氨基酸或氨基酸或

49、DL-氨基酸氨基酸 0.5或或1g/100mLpH6.82）制法）制法除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按氨基酸按0.5%加入，加入，DL-氨氨基酸按基酸按1%加入。再行校正加入。再行校正pH至至6.8。对照培养。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，上面滴加一层液体石蜡，115高压灭高压灭菌菌10min。3）试验方法）试验方法 从琼脂斜面上挑取培养物接种，于

50、从琼脂斜面上挑取培养物接种，于361培养培养1824h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。对照管应为黄色。13、蛋白胨水、蛋白胨水(靛基质试验用靛基质试验用)1）成分）成分 蛋白胨蛋白胨(或胰蛋白胨或胰蛋白胨)20g氯化钠氯化钠 5g蒸馏水蒸馏水 1000mLpH7.42）制法）制法按上述成分配制，分装小试管，按上述成分配制，分装小试管，121高压灭菌高压灭菌15min。3）靛基质试剂）靛基质试剂 柯