新编免疫组化.pptx

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1、第一部分第一部分 免疫细胞化学的理论基础免疫细胞化学的理论基础 免疫细胞化学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，以免疫学的抗原抗体反应为其理论基础。第1页/共112页第一节第一节 抗原（抗原（antigenantigen）一、抗原的概念 是一类在合适的条件下，能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质在体内和/或体外发生特异性结合反应的物质。抗原的性能：免疫原性 产生免疫应答 反应原性 产生特异性反应第2页/共112页二、抗原决定簇二、抗原决定簇 是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决定和控制抗原特异性的特殊化

2、学基团。是决定和控制抗原特异性的特殊化学基团。类型：类型：功能性抗原决定簇功能性抗原决定簇 隐蔽性抗原决定簇隐蔽性抗原决定簇 免疫优势决定簇免疫优势决定簇 线性或连续性决定簇线性或连续性决定簇 构象决定簇或不连续性决定簇构象决定簇或不连续性决定簇B 细胞所识别的是半抗原决定簇；细胞所识别的是半抗原决定簇；T细胞所识别的是免疫原细胞所识别的是免疫原性决定簇或连续性决定簇。性决定簇或连续性决定簇。第3页/共112页三、抗原的性质与种类三、抗原的性质与种类（一）抗原的性质（一）抗原的性质1、抗原的异物性、抗原的异物性 机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生免疫应答。该物机体能对进入体内的异种、

3、异体的大分子物质产生免疫应答。该物质与机体的种系关系愈远，其免疫原性愈强，机体的免疫反应也更强。质与机体的种系关系愈远，其免疫原性愈强，机体的免疫反应也更强。自身抗原；自身抗体自身抗原；自身抗体2、大分子胶体、大分子胶体 作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强 3、抗原的特异性、抗原的特异性 各种抗原物质各有其特异的抗原决定簇，即一种抗体只能与相应的各种抗原物质各有其特异的抗原决定簇，即一种抗体只能与相应的抗原起反应而不能与其它抗原反应。抗原起反应而不能与其它抗原反应。第4页/共112页（二）抗原的种类方法（二）抗原的种类方法 分类依据分类依据 种类种类单独存在时

4、是否有免疫原性单独存在时是否有免疫原性 半抗原和完全抗原半抗原和完全抗原抗原来源抗原来源 外源性抗原和内源性抗原外源性抗原和内源性抗原抗原与宿主关系抗原与宿主关系 异种抗原，同种异体抗原，自身抗原异种抗原，同种异体抗原，自身抗原B细胞产生抗体时是否需要细胞产生抗体时是否需要T细胞辅助细胞辅助 胸腺依赖抗原，胸腺非依赖抗原胸腺依赖抗原，胸腺非依赖抗原化学物质化学物质 蛋白质，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白，蛋白质，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白，核酸等核酸等物理状态物理状态 颗粒性抗原，可溶性抗原颗粒性抗原，可溶性抗原产生方式产生方式 天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原天然抗原，人工合成抗原，基因

5、工程抗原抗原特异性程度抗原特异性程度 特异性抗原，共同抗原特异性抗原，共同抗原完全抗原：完全抗原：同时具有免疫原性和反应原性的物质。同时具有免疫原性和反应原性的物质。不完全抗原或半抗原：不完全抗原或半抗原：无免疫原性。无免疫原性。第5页/共112页第二节第二节 抗体（抗体（antibodyantibody）一、抗体的概念一、抗体的概念 机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B B淋巴细淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白。与该抗原发生特异性反应的球蛋白。二、

6、抗体的性质和种类二、抗体的性质和种类（一）抗体的一般性质（一）抗体的一般性质 免疫球蛋白约等于抗体，分五类：免疫球蛋白约等于抗体，分五类：IgG,IgM,IgA,IgD,IgEIgG,IgM,IgA,IgD,IgE第6页/共112页（二）免疫原性和分类特性（二）免疫原性和分类特性 免疫球蛋白都是大分子蛋白质，具有免疫原性，课作为免疫球蛋白都是大分子蛋白质，具有免疫原性，课作为抗原。由于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此，分抗原。由于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此，分子结构差异较大，免疫原性比较复杂。子结构差异较大，免疫原性比较复杂。（三）抗体的种类（三）抗体的种类1、根据抗体的途径

7、或来源不同分为、根据抗体的途径或来源不同分为免疫抗体；天然抗体；自身抗体免疫抗体；天然抗体；自身抗体2、根据抗原抗体在试管内是否出现肉眼反应分为、根据抗原抗体在试管内是否出现肉眼反应分为完全抗体；不完全抗体完全抗体；不完全抗体第7页/共112页三、抗原与抗体反应三、抗原与抗体反应 称为免疫学反应。称为免疫学反应。在体内进行称为免疫反应；在体外称为血清学反应在体内进行称为免疫反应；在体外称为血清学反应四、抗体形成的机制四、抗体形成的机制（一）免疫应答的产生（一）免疫应答的产生1、感应阶段（识别及加工处理抗原阶段）、感应阶段（识别及加工处理抗原阶段）2、反应阶段（淋巴细胞增殖分化阶段）、反应阶段（

8、淋巴细胞增殖分化阶段）3、效应阶段（发生免疫反应阶段）、效应阶段（发生免疫反应阶段）（二）影响抗体产生的因素（二）影响抗体产生的因素1、抗原的质和量、抗原的质和量2、机体方面、机体方面3、佐剂的增强免疫作用、佐剂的增强免疫作用第8页/共112页第三节第三节 有关基本技术方法有关基本技术方法一、抗体的制备一、抗体的制备（一）抗体的制备方法（一）抗体的制备方法 能制备出具有很高特异性和敏感性的高效价能制备出具有很高特异性和敏感性的高效价多克隆多克隆和和单克隆单克隆抗体。抗体。第9页/共112页1.1.多克隆抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被动多克隆抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被

9、动免疫后从血清中分离提纯的抗体。免疫后从血清中分离提纯的抗体。2.2.单克隆抗体：是单克隆抗体：是19751975年由年由Kohlenh MilsteinKohlenh Milstein发明的一种新技发明的一种新技术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆成为单克

10、隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆抗体（抗体（monoclonal antibody,McAb)monoclonal antibody,McAb)第10页/共112页单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较 特性特性 多克隆多克隆 单克隆单克隆组成组成 多种类抗体的混合物多种类抗体的混合物 单一种类的抗体单一种类的抗体 特异性特异性 低低 高高 针对多个抗原决定族针对多个抗原决定族 针对单一的抗原决定族针对单一的抗原决定族亲和力亲和力 平均亲和力较高平均亲和力较高 不定，较低不定，较低交叉反应交叉反应 高高 低低第11页/共112页（二）抗体的配制方法1、抗

11、体贮存2、抗体使用液的配制第12页/共112页二、组织材料的处理二、组织材料的处理 尽量保存好抗原性不丢失、不扩散、不被破坏尽量保存好抗原性不丢失、不扩散、不被破坏三、免疫染色三、免疫染色1、增强特异性染色方法、增强特异性染色方法蛋白酶消化法；合适的抗体稀释度；温育时间蛋白酶消化法；合适的抗体稀释度；温育时间2、减少或消除非特异性染色方法、减少或消除非特异性染色方法3、显色反应的控制、显色反应的控制4、复染、复染第13页/共112页四、对照四、对照 阳性阳性对照；对照；阴性阴性对照对照五、结果的判断五、结果的判断（一）阳性细胞的染色特性（一）阳性细胞的染色特性1、分胞浆、细胞核、细胞膜表面阳性

12、、分胞浆、细胞核、细胞膜表面阳性2、灶状和弥漫性、灶状和弥漫性3、非特异性的认知、非特异性的认知4、切片质量不佳出现的阳性要排除、切片质量不佳出现的阳性要排除（二）染色失败的几种原因（二）染色失败的几种原因第14页/共112页第二部分第二部分免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术 Coons等（等（1941）通过荧光标记抗体，并借助于荧）通过荧光标记抗体，并借助于荧光显微镜观察荧光的发光物质，而建立的该项技术。光显微镜观察荧光的发光物质，而建立的该项技术。近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜等技近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜等技术的结合发展为定量免疫荧光技术。加之荧光激活细胞分

13、术的结合发展为定量免疫荧光技术。加之荧光激活细胞分类器的应用和激光共聚焦显微镜的问世，开创了免疫荧光类器的应用和激光共聚焦显微镜的问世，开创了免疫荧光技术的新领域。技术的新领域。第15页/共112页第一节第一节 原理原理一、基本原理一、基本原理 免疫荧光技术也是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的免疫荧光技术也是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。二、荧光产生的原理二、荧光产生的原

14、理 分子都含有电子，电子载不断的运动着。分子都含有电子，电子载不断的运动着。一般情况下，电子总是处于能量最低的能级（即基态）一般情况下，电子总是处于能量最低的能级（即基态）在一定的条例下，电子可吸收能量跃迁到较高的能量级在一定的条例下，电子可吸收能量跃迁到较高的能量级（即激发态），这个过程叫激发。（即激发态），这个过程叫激发。第16页/共112页第17页/共112页二、荧光素二、荧光素1、荧光色素、荧光色素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为。能够产生荧光并能作为染料的化合物称为。特性：必须具备吸收激发光的光能并发射荧光；具有吸收特性：必须具备吸收激发光的光能并发射荧光；具有吸收 一定频率光

15、能的生色团和能产生一定光亮子的荧光一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光 团。团。第18页/共112页2、用于标记抗体的荧光素、用于标记抗体的荧光素必须具备以下条件必须具备以下条件：1）应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易）应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。2）荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。）荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。3）结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。）结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。4）与蛋白质结合的方法简便

16、而快速。）与蛋白质结合的方法简便而快速。5）荧光素容易溶解，溶解后不会与其它物质发生化学反应。）荧光素容易溶解，溶解后不会与其它物质发生化学反应。6）荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判）荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。断结果。第19页/共112页3、荧光素的类型、荧光素的类型1）异硫氰酸荧光素（）异硫氰酸荧光素（fluorescien isothocyanate,FITC)2）四甲基异硫氰酸罗达明（）四甲基异硫氰酸罗达明（tetraethyl rhodamine isothocyanate,TRITC)3）四乙基罗达明（）四乙基罗达明（tetraeth

17、yl rhodamine,RB200)4）其它）其它第20页/共112页三、免疫荧光染色方法三、免疫荧光染色方法1、直接法直接法：用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异：用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异 性荧光抗体，直接用于细胞和组织抗原的检查。性荧光抗体，直接用于细胞和组织抗原的检查。优点：特异性高优点：特异性高缺点：一种荧光缺点：一种荧光 抗体只能抗体只能 检测一种检测一种 抗原。抗原。第21页/共112页2、间接法间接法：用特异性的抗体（：用特异性的抗体（1抗）与细胞或组织标本反抗）与细胞或组织标本反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合

18、的抗体，再用间接荧光抗体（光抗体（2抗）与结合再抗原上的抗体结合，形成抗）与结合再抗原上的抗体结合，形成抗原抗原 抗体抗体 荧光抗体的复合物荧光抗体的复合物。优点：荧光亮度增强，优点：荧光亮度增强，提高了敏感度提高了敏感度第22页/共112页四、非特异性染色的消除方法四、非特异性染色的消除方法1、非特异性染色的主要因素、非特异性染色的主要因素1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。）部分荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成

19、分非特异结合。特异结合。3）组织内类属抗原的存在。）组织内类属抗原的存在。4）从组织中难以提纯抗原性物质。）从组织中难以提纯抗原性物质。5）抗体分子上标记的荧光素太多。）抗体分子上标记的荧光素太多。6）荧光素不纯，标本固定不当。）荧光素不纯，标本固定不当。7）细胞和组织内某些物质自发荧光。）细胞和组织内某些物质自发荧光。8）染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本干燥。）染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本干燥。第23页/共112页2、消除的方法、消除的方法1）衬染法）衬染法（可抑制自发荧光）（可抑制自发荧光）2）胰蛋白酶消化）胰蛋白酶消化（可抑制非特异性荧光）（可抑制非特异性荧光）3）吸收）

20、吸收（用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色）（用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色）4）用正常）用正常（非免疫）血清（清除自发荧光和非特异性荧光）（非免疫）血清（清除自发荧光和非特异性荧光）5）提高抗体和荧光抗体的质量）提高抗体和荧光抗体的质量第24页/共112页五、荧光显微镜及检测方法五、荧光显微镜及检测方法略六、染色标本的保存六、染色标本的保存 原则上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时荧光原则上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时荧光最强。最强。用缓冲甘油封片，保存在用缓冲甘油封片，保存在4中，过夜后特异性荧光中，过夜后特异性荧光强度减弱强度减弱2525，保存，保存1 1周后减弱周后减弱

21、6060。第25页/共112页Nikon荧光显微镜荧光显微镜第26页/共112页第27页/共112页第28页/共112页肾活检（直接法）肾活检（直接法）肾活检（直接法）第29页/共112页肾活检（直接法）肾活检（直接法）低倍视野低倍视野肾活检（直接法），表达弱肾活检（直接法），表达弱第30页/共112页肾活检（直接法）肾活检（直接法）第31页/共112页肾活检（直接法）肾活检（直接法）第32页/共112页左图：表达在细胞核左图：表达在细胞核（FITC）右图：表达在胞膜右图：表达在胞膜第33页/共112页左图：左图：DAPI 染色染色（染核）（染核）右图：第34页/共112页第35页/共112页

22、胃胃粘粘膜膜上上皮皮细细胞胞，胞胞浆浆胞胞膜膜阳阳性性第36页/共112页血血管管内内弹弹力力膜膜阳阳性性第37页/共112页胃胃腺腺癌癌第38页/共112页第三部分第三部分免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是免疫组织化学中最常见的方法之一，它是在抗原抗体特异性反应存在的前提条件下，借助于酶学细胞化学手段，检测某种物质（抗原/抗体）组织细胞内存在部位的一门新技术。第39页/共112页第一节第一节 免疫组织化学的基本技术免疫组织化学的基本技术一、取材一、取材1.1.实验动物实验动物 麻醉麻醉 （处死），锋利刀片切成大小适中，厚度（处死），锋利刀片切成大小适中，厚度3mm3m

23、m4mm4mm。小型实验动物：灌注（流）固定后取材小型实验动物：灌注（流）固定后取材 （生理盐水和（生理盐水和4 4多聚甲醛）多聚甲醛）2.2.人体材料人体材料 活检组织、手术标本、细胞和组织活检组织、手术标本、细胞和组织第40页/共112页二、固定二、固定 原则是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用原则是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为1 112h12h。1.1.常用的固定剂常用的固定剂（1 1）甲醛缓冲液）甲醛缓冲液 广广泛泛应应用用于于病病理理标标本本的的固固定定，甲甲醛醛

24、在在很很好好地地保保护护组组织织形形态态结结构构完完整整的的同同时时也也有有效效地地保保存存某某些些抗抗原原。由由于于甲甲醛醛的的交交联联作作用用会会影影响响被被固固定定细细胞胞膜膜的的通通透透性性不不利利于于染染色色时时抗抗体体的的渗渗透透，因因此此染染色色前前常常用用酶酶进进行行消消化化以以使使抗抗原原决决定定簇簇充充分分暴暴露露，固固定定时时间间不不直超过直超过24h24h。第41页/共112页（2 2）4 4多聚甲醛磷酸缓冲液多聚甲醛磷酸缓冲液 广泛应用于光镜细胞化学研究。广泛应用于光镜细胞化学研究。（3 3）戊二醛多聚甲醛缓冲液）戊二醛多聚甲醛缓冲液 适用于光镜、电镜免疫组织化学研究

25、。适用于光镜、电镜免疫组织化学研究。（4 4）其它）其它 如如PLPPLP液（过碘酸液（过碘酸 赖赖AAAA多聚甲醛固定液）、丙酮及醇多聚甲醛固定液）、丙酮及醇 类、锇酸等。类、锇酸等。第42页/共112页2.2.固定注意事项固定注意事项（1 1）固定液的选择标准：）固定液的选择标准：A.A.组织形态结构保存良好。组织形态结构保存良好。B.B.最大限度保存抗原的抗原性。最大限度保存抗原的抗原性。（2 2）组织块的大小：）组织块的大小：1.5cm1.5cm0.5cm1.5cm1.5cm0.5cm为宜。为宜。（3 3）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。）固定时间：与组织块大小成正比

26、，与固定液浓度成反比。（4 4）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时 可放置在可放置在44冰箱。冰箱。（5 5）固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。）固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。第43页/共112页三、包埋三、包埋 1.1.石蜡包埋石蜡包埋 2.2.冷冻包埋冷冻包埋 3.3.环氧树脂包理环氧树脂包理四、切片四、切片 1.1.载玻片的处理载玻片的处理（1 1）清洗）清洗 （2 2）涂胶（防止脱片）。常用粘附剂：）涂胶（防止脱片）。常用粘附剂：明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。树脂胶：也称白胶。树脂胶：也称

27、白胶。多聚赖氨酸（多聚赖氨酸（PLLPLL）。）。商品化粘附剂。商品化粘附剂。第44页/共112页2.2.切片类型切片类型（l l）石蜡切片）石蜡切片 厚约厚约3 3 5m5m，放置，放置3737温箱烘烤过夜，以减少脱片。温箱烘烤过夜，以减少脱片。（2 2）冷冻切片：）冷冻切片：2m2m。（3 3）振振动动切切片片：特特点点是是组组织织经经固固定定后后不不需需包包埋埋，只只要要用用胶胶水水粘粘在在载载物物台台上上即即可可切切片片。切切片片较较厚厚，可可将将阳阳性性部部位位作作电镜包埋。神经组织应用较多。电镜包埋。神经组织应用较多。第45页/共112页第二节第二节 免疫组化染色过程中基本技术免疫

28、组化染色过程中基本技术一、蛋白酶消化技术一、蛋白酶消化技术 进进行行固固定定时时，抗抗原原决决定定簇簇有有可可能能被被固固定定剂剂所所封封闭闭，因因此此在在抗抗原原抗抗体体反反应应前前，常常用用蛋蛋白白酶酶处处理理组组织织切切片片，使使抗抗原原决决定定簇簇充充分分暴暴露露出出来来，并并使使组组织织的的通通透透性性增增高高，以以利利抗抗原原抗体最大限度地结合增强特异性染色。抗体最大限度地结合增强特异性染色。1.1.常用的消化酶常用的消化酶 胰蛋白酶、胃蛋白酶胰蛋白酶、胃蛋白酶2.2.消化时间消化时间 因因组组织织而而异异，一一般般为为5 530min30min，消消化化时时间间不不宜宜太太长长，

29、以以免免损损伤伤组组织织形形态态，破破坏坏抗抗原原决决定定族族。消消化化结结束束后后要要充充分分洗涤，以除去残留的蛋白酶洗涤，以除去残留的蛋白酶。第46页/共112页3.3.非特异染色的控制非特异染色的控制 非非特特异异染染色色或或背背景景染染色色是是指指在在免免疫疫组组化化染染色色过过程程中中凡凡不不属属于特异性抗原抗体反应所出现的染色。于特异性抗原抗体反应所出现的染色。（1 1）原因分析）原因分析组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱 性磷酸酶、内源性生物素等性磷酸酶、内源性生物素等.试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯

30、或标记过量等。试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。（2 2）消除方法）消除方法 加加1 1抗前加正常血清抗前加正常血清101030min30min，以封闭组织中带电荷的基因，以封闭组织中带电荷的基因，避免与避免与1 1抗的非特异性结合。抗的非特异性结合。第47页/共112页减少非特异性染色：减少非特异性染色：a.a.免免疫疫酶酶组组化化染染色色时时，在在加加1 1抗抗前前，用用0.3%0.3%的的H H2 2O O2 2甲甲醇醇溶溶液液将将组组织切片处理织切片处理30min30min（3%3%的的H H2 2O O2 2甲醇溶液处理甲醇溶液处理5 510min10min）。）

31、。b.b.免疫荧光染色时，可用免疫荧光染色时，可用0.010.010.050.05伊文思蓝稀释荧光抗体。伊文思蓝稀释荧光抗体。二、对照二、对照 阳性对照片：用已知抗原为阳性的标本作对照阳性对照片：用已知抗原为阳性的标本作对照 阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照第48页/共112页三、抗体的分装、稀释、滴加及保存三、抗体的分装、稀释、滴加及保存1.1.抗体的分装抗体的分装 不能用完的抗体分装在小的不能用完的抗体分装在小的EPEP管内，保存在管内，保存在-20-20-40-40的的低温冰箱中持用可保持数年有效。低温冰箱中持用可保持数年有效。2.2.抗体

32、稀释抗体稀释 常用常用0.01MPBS0.01MPBS（磷酸缓冲溶液）或（磷酸缓冲溶液）或BSABSA（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白）3.3.滴加滴加 滴滴加加抗抗体体要要充充分分覆覆盖盖组组织织切切片片，一一般般加加 303050L,50L,最最好好在在滴滴加加前前，用用蜡蜡笔笔或或特特制制的的组组化化笔笔在在组组织织周周围围画画一一圈圈,以以防防溶溶液液的扩散。的扩散。4.4.保存保存 未未用用完完的的抗抗体体可可在在低低温温冰冰箱箱或或冻冻干干保保存存，已已稀稀释释未未用用完完的的抗抗体最好在一周内用完，不宜长期保存。体最好在一周内用完，不宜长期保存。第49页/共112页四、免疫酶组织化

33、学技术和酶标抗体技术四、免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术1.1.免疫酶染色原理免疫酶染色原理 用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAPPAP法）和双法）和双PAPPAP法等。法等。（1 1）直接法原理：用酶直接标记在特异性）直接法原理：用酶直接标记在特异性1 1抗上，与标本中的抗上，与标本中的 抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗 原抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测

34、。原抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。第50页/共112页（2 2）间间接接法法原原理理：先先用用标标记记的的特特异异性性1 1抗抗与与标标本本中中相相应应抗抗原原结结合合，再再用用酶酶标标记记的的抗抗球球蛋蛋白白抗抗体体（2 2抗抗）孵孵育育，然然后后再再加加 酶酶的的底底物物，显显示示抗抗原原抗抗体体抗抗原原抗抗体体复复合合物物存存在在的的部部 位，以对抗原进行检测。位，以对抗原进行检测。如：如：1 1抗是由兔产生的多克隆抗体抗是由兔产生的多克隆抗体,则则2 2抗常用羊抗兔抗常用羊抗兔IgG

35、IgG；1 1抗是由鼠产生的单克隆抗体抗是由鼠产生的单克隆抗体,则则2 2抗常用羊或马抗鼠抗常用羊或马抗鼠IgGIgG。以上两种方法称为酶标抗体法（3 3）非非酶酶标标记记的的抗抗体体酶酶法法：是是以以酶酶为为抗抗原原免免疫疫动动物物，产产生生抗抗酶酶的的抗抗体体。通通过过酶酶与与抗抗体体的的特特异异性性结结合合进进行行标标记记。该该方方法法适用于石蜡包埋的组织切片。适用于石蜡包埋的组织切片。常用的有PAP、sABC、LsAB法（附图表说明）第51页/共112页（酶标识特异抗体（酶标识特异抗体（酶标识二次抗体（酶标识二次抗体第52页/共112页生物素生物素 HRPHRPALPALP第53页/共

36、112页2.2.常用的酶种类常用的酶种类 底物底物 沉淀颜色沉淀颜色HRP A.3,3HRP A.3,3氨基联苯胺氨基联苯胺DABDABH H2 2O O2 2 深褐色深褐色 B.5B.5氨基水杨酸氨基水杨酸 H2O2 棕色棕色ALP A.ALP A.苯酚磷酸盐重氮盐红色苯酚磷酸盐重氮盐红色 B.PB.P校际酚磷酸盐黄色校际酚磷酸盐黄色酸性磷酸酶酸性磷酸酶 GomouiGomoui液液葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 D D葡萄糖葡萄糖MTTMTT酚嗪磷酸酚嗪磷酸 甲酯化合物甲酯化合物 蓝色蓝色第54页/共112页第三节第三节 免疫组化的实际操作免疫组化的实际操作1.1.实验准备（必须器材）实验准备（

37、必须器材）（1 1）实验台：光线充足，方便操作。）实验台：光线充足，方便操作。（2 2）湿润盒：放置抗原抗体反应过程中反应，避免干燥。）湿润盒：放置抗原抗体反应过程中反应，避免干燥。（3 3）微量移液器：）微量移液器：1 120l,2020l,20200l,100200l,1001000l1000l。（4 4）其它：滤纸、纱布、吸头、）其它：滤纸、纱布、吸头、EPEP管、染缸、提篮等。管、染缸、提篮等。2.2.试剂药品试剂药品 （1 1）缓冲液：）缓冲液：PBS,0.01 MPBS,0.01 M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.2pH7.2）TBS,0.05 M TrisTBS,0.05 M T

38、ris盐酸缓冲液（盐酸缓冲液（pH7.6pH7.6）（2 2）抗体稀释液）抗体稀释液:1:1BSABSA或或0.01 MPBS0.01 MPBS （3 3）10102 2抗免疫动物的正常血清抗免疫动物的正常血清 （4 4）DBADBAH H2 2O O2 2显色液显色液 （5 5）核复染液：苏木素或甲基绿）核复染液：苏木素或甲基绿第55页/共112页 3.3.sABCsABC法的操作过程法的操作过程基本原理：基本原理：sABCsABC（strepto-avidin-biotin peroxidase strepto-avidin-biotin peroxidase complexcomplex

39、）链球菌抗生物素（卵白蛋）生物素过氧化物酶）链球菌抗生物素（卵白蛋）生物素过氧化物酶复合物复合物生物素(biotin):是一种分子量为244da的小分子的维生素。抗生物素(avidin):是一种糖蛋白，分子量为68KDa。生生物物素素与与抗抗生生物物素素有有很很强强的的亲亲和和力力，两两者者一一旦旦结结合合就就很很难难解解离离。同同时时生生物物素素与与抗抗生生物物素素都都有有与与其其它它示示踪踪剂剂如如荧荧光光素素，胶胶体体金金和和过过氧氧化化物物酶酶等等相相结结合合的的能能力力。所所以以生生物物素素-抗抗生生物物素素系系统统具具有灵敏度高、特异性强及方便快速等显着优点。有灵敏度高、特异性强及

40、方便快速等显着优点。附基本操作步骤第56页/共112页第57页/共112页第四节第四节 注意事项及结果判定注意事项及结果判定 要要想想得得到到理理想想的的结结果果，组组织织细细胞胞形形态态的的保保存存、抗抗原原性性的的保保存存、充充分分的的显显示示是是非非常常必必要要的的。要要满满足足这这些些条条件件，取取材材、固固定定、切切片片厚厚度度、操操作作过过程程、抗抗体体浓浓度度及及特特异异性性的的选选择择、操操作作前前蛋蛋白白酶酶的的消消化化、抗抗原原修修复复及及显显色色等等各各程程序序的的操操作不当均可导致不满意结果的产生。作不当均可导致不满意结果的产生。第58页/共112页1.取材固定取材固定

41、 标本要尽可能新鲜，取材固定要及时，固定液要新标本要尽可能新鲜，取材固定要及时，固定液要新 鲜鲜充足，防止组织破坏和抗原性的失活。充足，防止组织破坏和抗原性的失活。2.切片切片 切片不宜过厚，一般切片不宜过厚，一般4m左右。切片不宜过大，载玻左右。切片不宜过大，载玻片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放37温箱保温箱保存。存。第59页/共112页3.3.脱蜡脱蜡 脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯 5min35min3。4.4.蛋白酶消化蛋白酶消化 由由于于组组织织在在固固定定时时抗抗原原决决定定簇簇可可能能被被固固定定剂剂所所封封闭闭，

42、因因此此在在抗抗原原抗抗体体反反应应前前常常用用蛋蛋白白酶酶处处理理组组织织切切片片（根根据据1 1抗抗要要求求），使使抗抗原原决决定定簇簇充充分分暴暴露露出出来来，并并使使组组织织通通透透性性增增高高，使使抗抗体体充充分分结结合合抗抗原原，增增强强特特异异性性染染色色。一一般般用用0.1%0.1%胰胰蛋蛋白白酶酶或或胃胃蛋蛋白白酶酶消消化化5 530min30min。5.5.抗原修复抗原修复 一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，85859595，10min10min左右。左右。第60页/共112页6.6.抗体的选择抗体的选择 选选择择抗抗体体时时要要注注意

43、意是是用用于于冰冰冻冻切切片片还还是是用用于于石石蜡蜡切切片片的的抗抗体体，或或是是二二者者均均可可；其其次次要要看看抗抗体体说说明明，是是单单抗抗还还是是多多抗抗；适适用用于于哪哪些些组组织织；抗抗体体来来源源于于哪哪种种动动物物，由由此此来来选选择择2 2抗抗；还还有有抗抗体的稀度（在实验前根据预实验选择最佳浓度。体的稀度（在实验前根据预实验选择最佳浓度。7.7.特异性的确定特异性的确定 阴性对照（不加阴性对照（不加1 1抗，用抗，用PBSPBS或或TBSTBS代替）代替）阳性对照（已知确定阳性的组织）或买阳性对照片阳性对照（已知确定阳性的组织）或买阳性对照片显色：注意H2O2的浓度，必须

44、在显示前加入H2O2均匀搅拌，最佳显色时间在35min，过短或过长都不会出现满意的效果。第61页/共112页 9.9.复染复染 一般用苏木素一般用苏木素30s30s1min1min，过长复染将掩盖免疫组化的染色，过长复染将掩盖免疫组化的染色效果。效果。10.10.结果判定结果判定 判判断断是是否否阳阳性性或或阴阴性性，要要排排除除假假阳阳性性或或假假阴阴性性结结果果。也也要要学学会会判判断断特特异异性性染染色色和和非非特特异异性性染染色色。呈呈色色深深浅浅可可反反映映抗抗原原存存在在的的数量，可作为定性、定位和定量的依据。数量，可作为定性、定位和定量的依据。有有关关阳阳性性结结果果的的定定量量

45、判判断断，常常规规的的方方法法是是根根据据呈呈色色深深浅浅和和阳阳性细胞数量分类计算，以（性细胞数量分类计算，以（-）,+,+,+,+,+,+等分级和计数统计。等分级和计数统计。以下用图片说明第62页/共112页胃癌淋巴结转移胃癌淋巴结转移cerbB-2cerbB-2癌基因表达癌基因表达sABCsABC法法第63页/共112页胃癌，胃癌，P53P53抑癌基因表达，抑癌基因表达，sABCsABC法法第64页/共112页胃癌胃癌CerbB-2CerbB-2的表达，的表达，sABCsABC法法第65页/共112页胃癌胃癌cerbB-2cerbB-2的淋巴管侵袭，的淋巴管侵袭，sABCsABC法法第6

46、6页/共112页胃淋巴组织反应胃淋巴组织反应性增生，性增生，CD20/CD43CD20/CD43检测检测sABCsABC法法第67页/共112页胃组织中的反应性增生的淋巴组织，胃组织中的反应性增生的淋巴组织，CD43CD43表达，表达，sABCsABC法法第68页/共112页IgANIgAN，TGFs2TGFs2表达，主要在近曲肾小管内，表达，主要在近曲肾小管内，sABCsABC法法第69页/共112页IgAN,TGFs2IgAN,TGFs2的表达，的表达，sABCsABC法法第70页/共112页IgANIgAN，bFGFbFGF的表达，的表达，sABCsABC法法第71页/共112页IgAN

47、,PDGFIgAN,PDGF的表达，的表达，sABCsABC法法第72页/共112页骨骼肌营养不良，骨骼肌营养不良，myosinmyosin蛋白表达，蛋白表达，sABCsABC法法第73页/共112页第74页/共112页第75页/共112页第76页/共112页第77页/共112页第78页/共112页第五节第五节 免疫组织化学在病理诊断中的应免疫组织化学在病理诊断中的应用范围用范围1.1.肿瘤诊断肿瘤诊断 未分化恶性肿瘤性质判定；圆形、梭形、多形性肿瘤细未分化恶性肿瘤性质判定；圆形、梭形、多形性肿瘤细胞鉴别；转移肿瘤的原发部位的确定。胞鉴别；转移肿瘤的原发部位的确定。2.2.淋巴瘤的诊断淋巴瘤的

48、诊断 鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。3.3.内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素)4.4.软组织肿瘤；神经系统肿瘤软组织肿瘤；神经系统肿瘤第79页/共112页5.小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否)6.微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓)7.细针穿刺（细胞学诊断细针穿刺（细胞学诊断)8.8.部分肿瘤来源分类部分肿瘤来源分类9.9.乳腺癌激素受体检测（乳腺癌激素受体检测（ERER，PR)PR)10.10.肿瘤基因产物

49、（肿瘤基因产物（p53,cerb-B2,ALK,CDs)p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.11.增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（Ki-67Ki-67，PCNA)PCNA)判定肿瘤的预后判定肿瘤的预后12.12.病因诊断（病因诊断（HBVHBV，HCVHCV，EBVEBV，CMVCMV，HIVHIV等等)第80页/共112页第六节第六节 免疫组织化学在病理诊断中存免疫组织化学在病理诊断中存在的不足在的不足1.1.与分子生物学等技术相比，范围有限与分子生物学等技术相比，范围有限2.2.并非所有肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的抗体并非所有肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的抗体3.3.相

50、当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗体，常相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗体，常 常可表达多种肿瘤常可表达多种肿瘤4.4.免疫组织化学标准化问题免疫组织化学标准化问题第81页/共112页第四部分第四部分 免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术一、免疫电镜技术(immunoelection microscopy)是利用抗原和抗体特异性结合的原理，在超微结构水平定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。从细胞超微结构水平研究和观察抗原抗体的免疫反应，必须使抗体带上具有高电子密度的标记物，这样才能在电镜下观察反应分结果。到目前为止，已有三种标记技术：(1)铁蛋白标记技术 (2)酶标记技术 (