人体自身抗体检测技术综述.pdf

《人体自身抗体检测技术综述.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人体自身抗体检测技术综述.pdf（12页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、人体自身抗体检测技术综述人体自身抗体检测消化系统技术综述 本文关键词：抗体，综述，检测技术，人体人体自身抗体检测技术综述 本文简介：摘要：自身抗体对于自身免疫性疾病的诊断、鉴别诊断、疗效观察及预后推断判断具有重要意义。近年来,随着抗体筛选新技术的应用,更多种类的自身流感病毒冠状病毒被发现,其应用业务范围除自身免疫性疾病外,已扩展至神经系统疾病、肿瘤、消化、生殖及移植等领域。目前,自身抗体检测仍存在试剂参比溯源、检测过程一致性、结果同质互认等环境问题。人体自身抗体检测技术综述 本文内容：摘 要：免疫性自身淋巴细胞对于自身免疫性疾病的诊断、鉴别诊断、疗效观察及预后判断具有重要意义。近年来,随着抗体

2、甄选筛选新技术的应用,更当更多种类的自身抗体被发现,其应用范围除广泛应用自身免疫性疾病外,已扩展至大脑疾病、肿瘤、消化、生殖及移植等领域。目前,自身抗体检测仍存在试剂参比溯源、检测过程一致性、结果同质互认等结构性问题。制订试剂操作及标准化溯源规范将会引导自身抗体检测向自动化、微量化、智能化、高敏感、高通量的方向健康发展,以便更好地为临床产品服务。关键词：自身抗体;标准化操作;筛选技术;展望;Abstract：Autoantibodies are very important forautoimmune disease to diagnosis,differential diagnosis,cu

3、rative effect and prognosis.Recent years,with theapplication of the new antibody screening technology,agrowing many kinds of autoantibodies were discovered,and thescope of its application has been expanded to nervous systemdisease,tumor,digestive and reproductive and other fieldsbesides autoimmune d

4、isease.At present,there are manyproblems in autoantibody detection,such as the reagentcannot be compared with the source,the detection process isinconsistent,and the results cannot be homogenized.Thedevelopment of guidelines for the traceability andstandardization of reagents will guide to the direc

5、tion ofautomation,micromation,intelligence,high sensitivity andhigh throughput,in order to serve for clinic better.Keyword：autoantibody;standardized operations;screening technology;prospects;自身抗体是指针对自身组织工作、器官、细胞、细胞亚结构、体内蛋白分子、体内核酸等所有自身抗原的抗体总称,其本质为机体 B细胞分泌的免疫球蛋白1。自身抗体分为生理性自身抗体(或称天然自身淋巴细胞)(NAbs)和心律不整自身

6、抗体(PABs)。有研究显示,生理性自身抗体是维持机体处于健康状态的重要物质,多为 IgM 型,参与载具正常新陈代谢,减少体内细胞凋亡物质的堆积起来2。当机体免疫调节功能受损时,体内自身抗体大量产生,多为 IgG 型,与自身抗原亲和力高,形成的免疫激酶通过 FcR 激活炎性介质(细胞因子)或补体系统,导致自身免疫性疾病的发生,这种具有致病损伤病理性作用的自身抗体即为功能障碍自身抗体,即通常所称的自身抗体3。1、自身抗体的种类自身抗体种类很多,通常采用两种进行分类方法,一种为以疾病为中心,即相关自身抗体与该疾病有关,该分类法对于临床医生自身抗体项目申请具有重要意义,同时也有助于对该疾病与自身抗体

7、的全面认识;另一种为以靶抗原为中心,即其命名为抗靶抗原激素,这有助于对自身抗体性质的认识,也有助于自身抗体对靶向组织攻击造成推进器损伤的理解。从理论上讲,机体内存在多少种抗原,就能产生多少种自身抗体,因此,自身抗体错综复杂,种类可达成千上万种,自身抗体的命名应尽量根据抗体所专门针对的抗原进行,便于名称的统一。以靶抗原为中心的自身抗体分类见图1。1.1、常规自身抗体随着自身免疫的发展及检验技术的逐渐普及,自身抗体成为大多数医疗机构的常规检测项目,包括抗核抗体(ANA),抗核抗体谱包括抗 DNA、抗组蛋白及抗可提取性核抗体抗原(ENA)抗体谱等,抗中性粒细胞胞浆抗体包括抗蛋白酶 3 抗体(抗 PR

8、3)、抗髓过氧化酶抗体(抗 MPO)等,抗磷脂抗体(包括抗心磷脂抗体、抗 2 糖蛋白 I 抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体等),类风湿关节炎抗体(包括抗 CCP抗体、类风湿因子、抗角蛋白抗体等),自身免疫肝病抗体(包括抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体、抗肝肾微粒体-1 抗体等),肌炎相关抗体(包括抗 Mi-2、抗信号识别气泡抗体、抗 PM-Scl100 等),糖尿病抗体(主要包括谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛素抗体和胰岛细胞抗体等)。其中 ANA 与抗核抗体谱是临床开展最为普遍的几类两类项目。ANA 泛指抗淋巴细胞各种核及胞浆抗原成分的一大类抗原,推荐采用以 HEp-2细胞为底物的间接免疫荧光法进行检测。而抗核抗体

9、谱是指针对明确纯化抗原抗体的集合,其与传统的 ENA 抗体谱有所不同,传统 ENA 抗体谱检测通常采用磷酸盐缓冲液提取动物胸腺细胞核蛋白作为抗原底物4。但由于核成分中的 DNA 和组蛋白等碱性成分无法被磷酸盐缓冲液(pH=7.2)提取,因此,传统 ENA 抗体谱并未等等抗 DNA 抗体和抗体等碱性靶抗原的抗体。随着蛋白重组技术的进步,几乎所有酵素分子均可重组胺基酸合成,由于目前临床上很少采用传统 Western-blot 法进行 ENA 抗体谱的检测,从理论上讲,合成纯化抗原检测结果准确可信,且抗核抗体谱的检测范围远大于 ENA 抗体谱的范围。ENA 抗体谱概念不须被使用,因此,采用大量重组蛋

10、白的抗核抗体谱检测在临床上已趋普及,并被广大学者所接受。ANA 荧光矛盾图型与抗核抗体谱靶抗原对应关系见图2。图 1 以分类靶抗原为培训基地的自身抗体命名分类图1.2、新型自身抗体随着蛋白重组及自身抗体筛选技术的发展,大量新型自身开始集中抗体集中不断涌现,其中主要包括传统自身免疫疾病发现的一些自身抗体,另外在其他领域如神经系统疾病、肿瘤、生殖、肾脏疾病等也出现了一些新型癌症自身抗体,为其应用拓展了范围。肿瘤患者自身抗体组织通常与肿瘤反应或血清中的肿瘤相关抗原(TAA)的异常或过度表达相关,大部分的肿瘤自身抗体都是由 TAA 诱导产生的,为肿瘤的诊断和鉴别诊断提供了提供支持新的实验依据。近年来出

11、现的新型自身抗体见表 1。图 2 ANA 荧光图型与抗核抗体谱靶抗原对应关系表 1 近几年来出现的新型自身抗体2、自身抗体筛选和发现新型不具自身抗体的发现对于疾病诊断和认识具有重要意义。目前以 HEp-2 细胞为基质的 ANA 检测及以肝、肾组织为基质的 ANCA 和GBM 检测已经在流行病学广泛开展21,22,而临床实践过程中所,相当数量的医师和技师只关注熟悉已知的荧光抗体,情况下特殊少见荧光模型很多对于都主观认为是非特异性染色或杂质而忽略。实际上,临床工作中遇到未知之中荧光抗体图表时应做详细记录,并结合患者疾病或临床症状相结合进行分析,从而可能发现新的荧光模型与疾病之间的关系,有利于新型自

12、身抗体察觉到。此外,传统的 Western-blot 法也是工具发现新型自身抗体的检测方法。由于 ENA 抗原蛋白分离带非常多,临床上会发现一些其实不然的“杂带”,这些杂带可能就是与疾病相关的新型自身抗体,但临床医学中也常被忽略。目前,由于该法检测 ENA 抗体谱的局限性,以及检测结果的不确定性,Western-blot 法检测 ENA 抗体谱已很少转用,取而代之采用纯化通则抗原的线性免疫印迹法、化学发光气态法或液相芯片技术进行检测。虽说上述两种方法具有发现新型自身抗体的可能性,但荧光抗体检测基质及 ENA 提取物抗原种类有限,水溶性基质并未包括人体所有的抗原矿物,这是发现新型自身抗体的内在缺

13、陷。目前已发展出一些高效筛选自身抗体的方法。2.1、重组 cDNA 表达文库的血清学分析(SEREX)SEREX 技术是表现手法自身抗体筛选的重要手法,通过提取患者组织 mRNA 反转录成 cDNA 后导入噬菌体,并溶原性感染大肠杆菌构建 cDNA 表达文库,将表达产物转印在硝酸纤维前体膜上,接著与患者血清反应,然后对阳性克隆进行 PCR 测序鉴定即可得知抗原种类,同时也选出相应的自身抗体。2.2、噬菌体展示技术噬菌体展示技术是将外源基因插入噬菌体衣壳蛋白基因,使外源蛋白表达在噬菌体表面,表达外源蛋白的单个噬菌体构成噬菌体文库,展示的蛋白和血清中所 IgG 自身抗体反应后,筛选阳性噬菌体并扩增

14、鉴定,并采用测序方式确定自身抗原。2.3、蛋白芯片技术首先,纳入一定数量研究患者及匹配的对照,从而寻找患者与对照最为显着差异对比表达的信号,之后将选定的差异自身感染者免疫在大范围患者确认,以确定择定自身抗体球蛋白诊断疾病的有效性。目前,众多学者已尝试采用约 20 000 个重组女孩子蛋白的芯片,系统性地发现免疫有关疾病及肿瘤的自身抗体23。3、自身抗体检定新技术二十世纪 50 年代中期至 80 年代后期的 30 余年间,自身抗体的检测方法主要有间接免疫荧光法、放射免疫法、被动血凝法、颗粒凝集法、对流免疫电泳法、免疫双扩散法、放射免疫沉淀法、免疫印迹法等,主要从蛋白及多肽水平认识自身抗体。对于下

15、列检测方法而言,鉴于间接免疫荧光法检测结果的直观性、自身抗体检测的全面性,在今后一段时间内,该方法仍将是不可替代的筛选方法。上述自身抗体干扰素检测方法多为半定量的方法,难以标准化,使疾病诊断的特异度、灵敏度受到限制。上世纪90 年代后,随着纯化靶抗原技术的进步,试剂厂商采用纯化抗原制作试剂,提高了自身抗体的检测速度和抗原准确性。自身抗体的检测主要朝2 个方向发展,即多个激素自身抗体同时检测的高精度、高通量检测方法的液相芯片技术(又称多元流式点阵仪)和单项自身抗体精确检测的化学发光法。两种检测方法上均为高精度、全自动商业化大型检测仪器,但其各有特点,前者一次检测房地产项目最多达 100 多项,但

16、其必须组合项目同时检测,对于初诊患者而言,确实可以通过多个疾病的自身抗体组合,很快检测出上述检测疾病的自身抗体,但其医疗成本较高,对于确诊患者,只需要检测单个或假如数十个曾检测出的阳性自身抗体即可,这对于液相芯片而言,四项检测将造成资源浪费。随着医疗改革的大力推进,村民医疗将按疾病种类进行疾病保险支付,可促使医院及医生进行精确检测节约成本。若液相芯片单个检测无法的情况下,化学发光法将显示出其独特优势,可单个项目检测,且成本可控,因此,试剂仪器生产商将会对技术及检测成本进行竞争,让临床能够给予更多、更好的选择。4、自身抗体检测标准及共识标准或互信是讨论专家对现状讨论分析后的操作建议。自身抗体检测

17、共识的建立恰恰是因为自身抗体检测规范、不统一、结果可比性差的前例现实背景下达成的一致意见。行业协会为提高检测质量及结果可比性做出了。到目前为止,主要有两类封闭式自身抗体(ANA及 ANCA)制定了部分规范。4.1、ANA 检测规范2021 年欧洲自身免疫标准化北美促进会和自身抗体标准化委员会共同发表了抗核抗体检测的国际建议。2021 年 8 月在第 12 届自身抗体和自身免疫国际研讨会议上,形成 ANA 荧光模型国际共识,提出关于 ANA 荧光模型标准化分类命名的国际共识。中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会于2021 年医学杂志在中华抽样医学杂志上发表了中国 ANA 检测共识

18、24,主要建议包括:(1)推荐以 HEp-2 细胞为实验基质的 IIF 法是进行 ANA 筛查的参考方法和首选方法;(2)建议 ANA 检测时,HEp-2 细胞在实验基质中每显微镜视野(放大倍数为 200 倍)应可见 35 个有丝分裂细胞;(3)二抗应使用荧光素标记的抗人 IgG 抗体;(4)IIF 法检测 ANA 的稀释方法可根据不同的检测试剂而采用倍比稀释系统或根号10 稀释系统;(5)当临床高度疑诊时,不论 ANA 总抗体的鉴别结果如何,都需要对针对靶抗原的特异性自身抗体进行检测;(6)对 ANA 荧光模型做了相应其要求,必报荧光二维包括:均质型、斑点型,细胞核致密斑点标准型、着丝点型、

19、核点型、核仁型、胞浆颗粒型、线粒体型、高尔基体型、棒环状型、核膜型,肌动蛋白型。4.2、ANCA 检测规范近年来发表了 ANCA 检测共识25,26,其主要意见如下:(1)当患者表现为肾小球肾炎(特别是快速进展的肾小球急速肾炎)、有系统特征的皮肤型血管炎,多个肺结节、上呼吸道慢性破坏性疾病、长期鼻窦炎或原发性、声门下气管狭窄、多发性单神经炎或其他周围神经病变、眶后肿块、巩膜炎等需检测ANCA;(2)检测抗 MPO 抗体、抗 PR3 抗体的高标准方法应作为 ANCA 的筛查实验;(3)若抗 MPO 抗体、抗 PR3 抗体阴性,医学但临床高度怀疑小血管炎时,应推荐到有经验的实验室进行检测;(4)抗

20、 MPO 抗体、抗 PR3 抗体阴性时,不能除去腺相关病毒(AAV);(5)抗 MPO 抗体、抗 PR3 抗体阳性有助于诊断AAV,但不可仅凭此诊断。5、自身抗体检测的检测问题及发展大方向自身抗体测试结果在同质化和结果互认方面存在很大障碍,原因主要就有以下两个方面,第一为试剂溯源问题,目前关于抗原试剂性能评价并无可以参比的国际组织,因此,检测结果通常会出现抗体滴度强弱不等。当厂商试剂对比检测结果出现差异时,无法确定哪家试剂检测较高准确度较高,临床通常采用检测结果与临床疾病诊断符合率进行分析,这虽说是一种比较好的好评价方法,但大多数自身免疫病的诊断标准多为多项指标综合判断,患者疾病异质性大的,特

21、别要评价的自身抗体测试指标往往是辅助指标,自身妇科疾病抗体在疾病预示着价值方面存在缺陷,该指标在增加灵敏度的同时必然会损失特异度,因此给临床和实验室造成巨大困难,这将是今后自身抗体检测面临的最大问题。第二为实验操作问题,目前多数自身抗体检测仍以手工操作或半自动仪器为主,检测结果仍受检测方法、检验试剂、检验仪器及实验人员的经验性等诸多因素影响,特别是荧光抗体检测受人为因素影响更大,包括荧光显微镜的质量、技师对图像的认识、荧光强度的感知、视力的好坏等。目前已有医院开始采用电脑图像采集,然后通过观察显示器上图像进行结果判读,这也带来新的问题,如各公司图像采集卡的质量和参数不同,显示器分辨率及显卡质量

22、等存在很大差异,同一图像在不同条件下可以得出完全不同的结果,这一点值得实验室执法人员注意。不久的将来,自身抗体检测将迎来短期粗犷的发展和长期规范的调整。随着自身抗体筛选新技术应用的广泛应用,将筛选出与与各系统疾病有关的新型自身抗体,对于疾病诊断、鉴别诊断及发病机制的研究将提供的实验依据。此外,为了更好地将自身抗体检测结果应用于免疫临床,并达到结果互认,建议国际国际上行业协会等部门牵头制订试剂溯源及标准化国内操作规范,从顶层设计或行业强制自身的高度规范标准抗体检验的试剂生产商、检测实验室及临床医生应用行为。从发展的角度而言,自身抗体检测最终将移动式全面实现全自动化、高通量、标准化和人工智能,从而

23、显着突显提高自身抗体检测质量,实现不同研究组结果互认,提高实验室临床服务能力。参考文献1 RIGON A,INFANTINO M,MERONE M,et al.The inter-observer reading variability in anti-nuclear antibodiesindirect(ANA)ifluorescence test:A multicenter evaluationand a review of the literatureJ.Autoimmun Rev,2021,16(12):1224-1229.2 BURCH P R,ROWELL N R.Do natur

24、al autoantibodiesprevent autoimmune disease?J.Il Today,1987,8(3):73-74.3 BAUM S,SAKKA N,ARTSI O,et al.Diagnosis andclassification of autoimmune blistering diseasesJ.AutoimmunRev,2021,13(4/5):482-489.4 SELMI C,CERIBELLI A,GENERALI E,et al.Serumantinuclear and extractable nuclear antigen antibodypreva

25、lence and associated morbidity and mortality in thegeneral population over 15yearsJ.Autoimmun Rev,2021,15(2):162-166.5 RU J L,ZHAO Y,XIE X X,et al.Clinicalapplications of the indirect ifluorescence assay fordetection of anticell membrane-associated DNA antibodies injuvenile systemic lupus erythemato

26、susJ.Pediatr Res,2021,77(2):376-380.6 YEE A,WEBB T,SEAMAN A,et al.Anti-CarPantibodies as promising marker to measure joint damage anddisease activity in patients with rheumatoid arthritisJ.IlRes,2021,61(1/2):24-30.7 VISHWANATH S,EVERETT S,SHEN L,etal.Xerophthalmia of sjogrensyndrome diagnosed withAn

27、tiSalivary gland protein 1antibodiesJ.Case Rep Ophthalmol,2021,5(2):186-189.8 RUGGENENTI P,DEBIEC HANNA,RUGGIERO B,etal.Anti-Phospholipase A2receptor antibody titer predictsPost-Rituximab outcome of membranous nephropathyJ.J Am SocNephrol,2021,26(10):2545-2558.9 HOSHINO K,MURO Y,SUGIURA K,et al.Anti

28、MDA5andanti-TIF1-gamma antibodies have clinical significance forpatients with dermatomyositisJ.Rheumatology,2021,49(9):1726-1733.10YANG H,PENG Q,YIN L.Identification of multiplecancer-associated myositis-specific autoantibodies inidiopathic inflammatory myopathies:a large longitudinalcohort studyJ.A

29、rthritis Res Ther,2021,19(1):259.11 KOICHI Y,AYA Y,MEGUMI U,et al.A case ofantiMDA5-positive rapidly progressive interstitial lungdisease in a patient with clinically amyopathicdermatomyositis ameliorated by rituximab,in addition tostandard isuppressive treatmentJ.Mod Rheumatol,2021,27(3):536-540.12

30、YANG Y,YUAN C,SHEN S Q,et al.Autoantibodies toNR2Apeptide of the glutamate/NMDA receptor in patients withseizure disorders in neuropsychiatric systemic lupuserythematosusJ.Mediators Inflamm,2021,74(5):5047898.13 HUI A T,LAM Y O,CHAN C K,et al.A case ofrefractory seizure with cognitive impairment due

31、 to anti-GABAencephalitisJ.Hong Kong Med J,2021,22(5):509-511.14VERKMAN A S,PHUAN P W,ASAVAPANUMAS N,etal.Biology of AQP4and anti-AQP4antibody:therapeuticimplications for NMOJ.Brain Pathol,2021,23(6):684-695.15 NOZOE T,NOZOE E,KONO M,et al.Further evidenceto demonstrate the significance of serum app

32、earance of anti-p53antibody as a marker for progressive potential in invasiveductal carcinoma of the breastJ.J Med Invest,2021,64(3.4):241-244.16 LIST M,JAMOUS F,GUPTA A,et al.Anti-Hupositive antibodies and small cell carcinoma:a single centerreviewJ.S D Med,2021,68(6):251,253-5.17KAY L,BAUER S,KOCZ

33、ULLA A R,et al.Ondinecurseand temporal lobe seizures:anti-Hu-and Zic4-associatedparaneoplastic brainstem and limbic encephalitisJ.Eur JNeurol,2021,25(5):e59-e60.18 LINNOILA J,GUO Y,GADOTH A,et al.Purkinje cellcytoplasmic antibody type I(anti-Yo):predictive ofgastrointestinal adenocarcinomas in menJ.

34、J Neurol NeurosurgPsychiatry,2021,89(10):1116-1117.19KUNSTREICH M,KRETH J H,OOMMEN P T,etal.Paraneoplastic limbic encephalitis with SOX1andPCA2antibodies and relapsing neurological symptoms in anadolescent with Hodgkin lymphomaJ.Eur J Paediatr Neurol,2021,21(4):661-665.20 GREENE M,LAI Y,BAELLA N,et

35、al.Antibodies todelta/notch-like epidermal growth factor-related receptor inpatients with anti-Tr,paraneoplastic cerebellar degeneration,and hodgkin lymphomaJ.JAMA Neurol,2021,71(8):1003-1008.21 XU P C,CHEN T,GAO S.Clinical and pathologiccharacteristics of pauci-immune anti-myeloperoxidase antibodya

36、ssociated glomerulonephritis with nephrotic rangeproteinuriaJ.Ren Fail,2021,40(1):554-560.22TAMAMOTO T,NAGAO A,SUGANO M.Detection of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in dogs with immune-mediated inflammatory diseasesJ.Vet Il Ipathol,2021,203(5):47-51.23HU C J,PAN J B,SONG G,et al.Identificatio

37、n ofnovel biomarkers for behcet disease diagnosis using humanproteome microarray approachJ.Mol Cell Proteomics,2021,16(2):147-156.24中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会.抗核抗体检测的临床应用专家共识J.中华验证医学杂志,2021,41(4):275-280.25 BOSSUYT X,COHEN TERVAERT J W,ARIMURA Y,etal.Position paper:Revised 2021international consensus ontesting of ANCAs in granulomatosis with polyangiitis andmicroscopic polyangiitisJ.Nat Rev Rheumatol,2021,13(11):683-692.26 中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测研究者委员会.抗中性粒细胞胞浆抗体溶酶体的临床应用专家共识J.中华验证医学杂志,2021,9(41):644-650.