2琼脂糖凝胶电泳.ppt

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1、Agarose Gel Electrophoresis 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2023/3/111After the experiment is finished,students should know how to make an agarose gel.掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。一、实验目的一、实验目的(Experimental Purpose)2023/3/112Gel electrophoresis2023/3/113二、实验原理二、实验原理(Experimental Principle)Electrophoresis is a techn

2、ique used to separate and sometimes purify proteins and nucleic acids,which differ in size,charge or conformation from each other.Electrophoresis has become the most widely used techniques in biochemistry and molecular biology.电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分子构象有所不同的生物大分子状或分子构象有所不同的生物大分子尤

3、其是蛋尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一。分子生物学中应用最为广泛的技术之一。2023/3/114Agarose is a polysaccharide extracted from seaweed.Agarose gels have a large range of separation,but relatively low resolving power.By varying the concentration of agarose,fragments of DNA from about 200

4、 to 50,000 bp can be separated using standard electrophoretic techniques.琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离的电泳技术可以分离200到到50,000 bp 大小的大小的 DNA 片断。片断。琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶浓浓度度越越大大，凝凝胶胶就就越越硬硬。较较高高浓浓度度的的琼琼脂脂糖糖胶胶有有利利于于较较小小的的DNA片片断断分分离离，而而较较低

5、低浓浓度度的的琼琼脂脂糖糖胶胶则则可可以分离较大的以分离较大的DNA片断。片断。The higher the agarose concentration,the stiffer the gel.Higher concentrations of agarose help in the separation of small DNAs,while low agarose concentrations allow resolution of larger DNAs.2023/3/115 Agarose is typically used at concentrations of 0.5%to 2%.

6、The distance DNA has migrated in the gel can be judged by visually monitoring migration of the tracking dyes.琼脂糖胶浓度一般在琼脂糖胶浓度一般在0.5到到2之间。之间。通通过过观观察察示示踪踪染染料料的的迁迁移移距距离离可可以以判判断断DNA的的迁迁移移距距离离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率最大。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率最大。当迁移足够距离后，就可以通过当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察染色来观察DNA片断。片断。When adequate migrati

7、on has occured,DNA fragments can be visualized by staining with Gelview.2023/3/116琼脂糖琼脂糖凝胶浓凝胶浓度度0.3%0.6%0.9%1.2%1.5%2%DNA片片段分离段分离范围范围6-60 kb1-20 kb 0.5-7kb 0.4-6kb 0.2-3kb 0.1-2kb2023/3/117Gelview is a fluorescent dye.It is often incorporated into the gel so that staining occurs during electrophores

8、is,but the gel can also be stained after electrophoresis by soaking in a dilute solution of Gelview.To visualize DNA or RNA,the gel is placed on a ultraviolet transilluminator.Gelview是是一一种种荧荧光光染染料料。它它可可以以在在做做胶胶时时混混入入其其中中在在电电泳泳时时进进行行染染色色，也也可可以以待待电电泳泳完完成成后后将将凝凝胶胶浸浸泡泡在在稀稀释释的的Gelview 溶溶液液中中进进行行染染色色。但但必必

9、须须将将凝凝胶胶置置于于紫紫外外透透射射仪仪中中才可以对凝胶中的才可以对凝胶中的DNA或或RNA进行观察。进行观察。2023/3/118三、试剂与器材三、试剂与器材（Reagents and apparatus）1.Agarose.2.TBE 5 stock solution(1 liter):54 g Tris base,27.5 g boric acid,20ml 0.5 M EDTA,pH 8.0.3.10 loading buffer:0.25%bromophenol blue,40%sucrose in water.4.Equipment:beaker,graduated cylin

10、der,stir bar,microwave,Pan balance,comb,electrophoresis tank,and Electro-phoresis System,Ultraviolet transilluminator.5.Gelview2023/3/119.Preparation of the gel（凝胶的制备）（凝胶的制备）1.制制备备1琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶。称称取取0.5g琼琼脂脂糖糖，放放人人锥锥形形瓶瓶中中，加加入入50mL的的 0.5TBE 缓缓冲冲液液，放放入入微微波波炉炉加加热热至至完完全全溶溶化化，则则为为1琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶液液。（由由于于蒸蒸发发作作用

11、用，溶溶解解前前在在容容量量瓶瓶上上作作一一个个记记号号，溶溶解解后后用用三三蒸蒸水补足水补足）四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)2023/3/11102.2.制胶器的安装制胶器的安装取多功能制胶器，洗净，晾干；取多功能制胶器，洗净，晾干；将多功能制胶器放置于一水平位置，选择将多功能制胶器放置于一水平位置，选择126cm制胶架，然后选择制胶架，然后选择1.5mm 18teeth的梳子（最大加样的梳子（最大加样量量25l）；）；将所选择规格的梳子插入制胶架的定位槽中。将所选择规格的梳子插入制胶架的定位槽中。2023/3/11113.将熔化的琼脂糖凝胶液转入

12、将熔化的琼脂糖凝胶液转入Gelview专用的三专用的三角瓶角瓶中，然后加入中，然后加入Gelview 5l。4.将冷到将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入所选择的制胶槽内，直至有机玻璃板上形成所选择的制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面一层均匀的胶面(注意不要形成气泡注意不要形成气泡)。5.待胶凝固后（待胶凝固后（30-60min），轻轻拔掉梳子，），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内。将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内。6.加入电泳缓冲液加入电泳缓冲液(0.5)至电泳槽中。至电泳槽中。2023/3/1112.Loading DNA sa

13、mples(加样加样)用移液枪缓慢将用移液枪缓慢将DNADNA样品垂样品垂直加入加样孔直至开口下方。直加入加样孔直至开口下方。1.1.DNA samples：10l2.Loading buffer (6X)：2l3.DNA markers：6l Total 12l2023/3/1113.Gel（电泳）（电泳）1.1.接通电泳槽与电泳仪的电源接通电泳槽与电泳仪的电源(注意注意正负正负极极，DNADNA片段从负极向正极移动片段从负极向正极移动)。保持电。保持电压压 606080 V80 V。2.2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm1-2cm处，处，停止电泳。停止电

14、泳。2023/3/1114.Gel Interpretation（凝胶图像解释）（凝胶图像解释）The uncut DNA lane may have several bands in it.This occurs because the mobility of plasmid DNA in an agarose gel depends on its molecular conformation as well as its size in base pairs.Plasmid DNA can exist in any one of three major conformations:未切割的

15、质粒未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒DNA以以下列三种主要构象中的任何一种形式存在：下列三种主要构象中的任何一种形式存在：2023/3/1115Supercoiled-plasmid is usually seen as a supercoil in a bacterial cell.This form of the plasmid will move the fastes

16、t through the gel due to its compact structure.超超螺螺旋旋质质粒粒在在细细菌菌细细胞胞以以超超螺螺旋旋结结构构存存在在，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。2023/3/1116 Nicked-During plasmid DNA replication,topoisomer-ase I introduces a nick into one strand of the DNA helix and uncoils the plasmid.Physical shearing and enzymatic

17、cleavage during plasmid isolation may also introduce nicks into the supercoiled plasmid to produce a relaxed open circular structure.切切口口在在质质粒粒DNA复复制制过过程程中中，拓拓扑扑异异构构酶酶I会会在在DNA双双螺螺旋旋中中的的一一条条链链中中引引入入一一个个切切口口，解解开开质质粒粒的的超超螺螺旋旋。在在质质粒粒分分离离过过程程中中由由于于物物理理剪剪切切和和酶酶的的切切割割作作用用同同样样也也会会在在超超螺螺旋旋质质粒粒中中引引入入切切口口从从而而产

18、产生生松松散散的的开开环环结结构构。这这种种形形式式的的质质粒粒迁迁移移速速率率介介于于超超螺螺旋旋和和线线性性DNA之间。之间。2023/3/1117LinearLinear plasmid DNA occurs when damage results in strand nicks directly opposite each other on the DNA helix.This form is the slowest migrating form of plasmid.The presence of linear DNA in a plasmid preparation is a si

19、gn of either nuclease contamination or sloppy lab procedure.线线性性当当DNA损损伤伤在在DNA双双链链相相对对应应的的两两条条链链上上同同时时产产生生切切口口时时，就就会会出出现现线线性性质质粒粒DNA，这这种种DNA的的泳泳动动速速率率最最慢慢，质质粒粒制制备备过过程程个个出出现现线线性性DNA说说明明存存在在核酸酶污染或实验操作有问题。核酸酶污染或实验操作有问题。2023/3/1118五、实验结果五、实验结果(experimental results)1、DNA相对分子质量标准物相对分子质量标准物（maker）2、pUC19质粒

20、质粒DNA经经EcoRI完全酶解完全酶解3、pUC19质粒质粒DNA经经EcoRI部分酶解部分酶解4、自提的、自提的pUC19质粒质粒DNA（此结果提得较好，为（此结果提得较好，为1条带，条带，以超螺旋为主。）以超螺旋为主。）2023/3/1119六、注意事项六、注意事项(Notes)The mobility of the DNA depends on the following factors：a.Molecular size of DNA DNA的分子大小的分子大小分子量越小，迁移越快。分子量越小，迁移越快。b.Agarose concentration 琼脂糖浓度琼脂糖浓度浓度越低，迁移

21、越快。浓度越低，迁移越快。c.Conformation of the DNA DNA的的构构象象环环状状的的或或带带切切口口环环状状的的DNA通通常常比比线状的线状的DNA迁移要快。迁移要快。d.Voltage per cm distance between electrodes 两两个个电电极极之之间间单单位位厘厘米米的的电电压压电电压压越越高高，迁迁 移越快。移越快。2023/3/11204.Troubleshooting.（问题及原因）（问题及原因）If the DNA bands are not sharp and uniform,it may be due to the following reasons 如如果果DNA条条带带不不够够窄窄且且不不够够均均匀，可能是内以下原因所引起：匀，可能是内以下原因所引起：a.Overloaded DNA DNA过载过载 b.Voltage too high 电压过高电压过高 c.Torn well 加样孔破损加样孔破损 d.Bubble in gel 凝胶中有气泡凝胶中有气泡2023/3/1121