分子杂交技术.ppt

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1、第五节第五节 核酸的分子杂交核酸的分子杂交Nucleic Acid HybridizationNucleic Acid HybridizationContent of Table 前前 言言1 1 核酸分子杂交技术的原理核酸分子杂交技术的原理2 2 核酸探针的制备核酸探针的制备3 3 核酸探针的标记核酸探针的标记4 4 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术5 5 生物芯片技术生物芯片技术 前前 言言 核酸分子杂交核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性变性DNADNA或或RNARNA单链，经退火处理形成单链，经退火处理形成DNA-DNADNA-DN

2、A或或DNA-RNADNA-RNA这一过程叫这一过程叫分子杂交分子杂交。Home1 核酸分子杂交技术的原理核酸分子杂交技术的原理 有互补特定核苷酸序列的单链有互补特定核苷酸序列的单链DNADNA或或RNARNA混在一起时，混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。其相应同源区段将会退火形成双链结构。如把一段如把一段已知基因（已知基因（DNADNA或或RNARNA）核酸序列用合适标记）核酸序列用合适标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针当作探针（probe),probe),与变性后的单链基因组与变性后的单链基因组DNADNA或或RNAR

3、NA进行杂交。进行杂交。再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。拷贝数及表达丰度等。应应 用：用：(1)(1)检测特定生物有机体之间是否存在检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；亲缘关系；(2)(2)用来揭示核酸片段中某一特定基因用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。的存在与否、拷贝数及表达丰度。Home2 核酸探针的制备核酸探针的制备 2.1 2.1 探针（探针（Probe)Probe)的概念的概念

4、:一段带有检测标记的与目的基因或目一段带有检测标记的与目的基因或目的的DNA特异互补的已知核苷酸序列。特异互补的已知核苷酸序列。2.2 探针的制备方法探针的制备方法长度一般以长度一般以50300bp为宜。制备方法：为宜。制备方法：(1)DNA重组技术重组技术 (2)PCR扩增扩增 (3)化学合成化学合成2.3 探针的分类探针的分类 据来源及性质不同可分为：据来源及性质不同可分为：(1)基因组基因组DNA探针探针(2)cDNA探针探针(3)RNA探针探针(4)寡核苷酸探针寡核苷酸探针2.4 合成寡核苷酸探针注意原则合成寡核苷酸探针注意原则(1)(1)长度（长度（10-50 10-50 bpbp)

5、;);(2)G:C(2)G:C对含量对含量40%-60%40%-60%；(3)(3)探针内避免互补；探针内避免互补；(4)(4)避免同一碱基连续出现；避免同一碱基连续出现；(5)(5)与非靶序列有与非靶序列有70%70%以上同源性或连续以上同源性或连续8 8个以上碱基序列相同，最好不用。个以上碱基序列相同，最好不用。Home3 核酸探针的标记核酸探针的标记 为确定为确定探针是否与相应基因组探针是否与相应基因组DNADNA杂交杂交，有必要对探针加以标记，以便，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。在结合部位获得可识别的信号。3.1 标记的种类标记的种类 同位素：同位素：3232P

6、 P、3535S S、3 3H H、125125I I等标记探针等标记探针非同位素：非同位素：生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。存时间较长，无同位素污染。一个理想的标记物应满足：(1)(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同标记前后探针基本结构、化学性质相同;(2)(2)特异性强、本底低、重复性好；特异性强、本底低、重复性好；(3)(3)操作简单、节时；操作简单、节时；(4)(4)安全、无环境污染。安全、无环境污染。3.2 探针的标记方法探针的标记方法3

7、.2.1 3.2.1 缺口平移法缺口平移法3.2.2 3.2.2 随机引物标记法随机引物标记法3.2.3 3.2.3 末端标记法末端标记法3.2.4 3.2.4 生物素光照标记法生物素光照标记法Home缺口平移法的原理缺口平移法的原理 将将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的的53的聚合酶活性和的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。的外切酶活性相结合。首先用首先用E.coli的的DNAse I 在探针在探针DNA双链上造成缺口，然双链上造成缺口，然后再借助于后再借助于DNA pol I的的53外切酶活性，切去带有外切酶活性，切去带有5

8、-磷磷酸的核苷酸；同时利用该酶酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生物素聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。这两种活性同时作用，缺口不断向这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，方向移动，DNA链链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。探针。Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列随机引物标记法原理随

9、机引物标记法原理 用一些用一些六核苷酸作为随机引物六核苷酸作为随机引物，将这些，将这些引物和探针引物和探针DNADNA片段一起热变性，退火后，片段一起热变性，退火后，引物与单链引物与单链DNADNA互补结合，再互补结合，再在在DNADNA聚合酶的聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其作用下，按碱基互补配对原则不断在其3-3-OHOH端添加标记的单核苷酸修补缺口端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新，合成新的标记的探针片段。的标记的探针片段。末端标记法原理末端标记法原理（1）一种是在）一种是在5末端加成标记法末端加成标记法：先用先用碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AP）去掉）去掉dsDNA 5-磷磷酸，

10、再用酸，再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化标记的催化标记的ATP 的的-磷酸磷酸转移加到转移加到DNA片段片段5-OH上。上。（2）在探针）在探针3-末端末端用末端转移酶用末端转移酶掺入一个掺入一个单标记的单标记的-32PdNTP。核酸修饰酶3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、ddNR、NR的5-OH上加磷,用于探针的末端同位素标记3 HO5 HO3 HO5 HOp 5p 53 HO3 HOT4-PNPpppATP生物素光照标记法生物素光照标记法 光敏生物素在紫外线照射下与光敏生物素在紫外线照射下与DNADNA或或RNARNA的碱基发生化学加成

11、反的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的应，获得生物素标记的DNADNA探针。探针。4 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 此技术由此技术由Southern 1975年首先设年首先设计。被检测对象为计。被检测对象为DNA。4.1 Southern 印迹杂交印迹杂交带有带有DNA片段的凝胶片段的凝胶DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳至至膜（尼龙膜或硝酸膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）纤维素滤膜）上上转膜转膜杂交、显影杂交、显影凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液转移用缓冲液转移DNADNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern Southern 印迹杂交的技术

12、流程印迹杂交的技术流程白瓷盘白瓷盘玻玻璃璃板板滤滤纸纸凝胶凝胶尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板重物重物吸水纸转膜吸水纸转膜。真空转膜槽真空转膜槽滤滤纸纸尼尼龙龙膜膜凝胶凝胶盖子盖子+-真空转膜真空转膜4.2 Northern印迹杂交印迹杂交 与与SouthernSouthern杂交类似。杂交类似。检测检测目的目的RNARNA的存在与否及含量。的存在与否及含量。4.3 Western4.3 Western印迹杂交印迹杂交 将待检测蛋白质（或酶）经将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体抗体-抗原抗原”免疫反应或免疫

13、反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。4.4 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dot blotting and slot blotting 适于核酸样品定量检测，而不是适于核酸样品定量检测，而不是定性检测。定性检测。4.5 原位杂交原位杂交in situ hybridization分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交Home5 5 生物芯片生物芯片 生物芯片生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微中迅速发展起来的一项高新

14、技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型微型生物化学分析系统生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、，以实现对细胞、蛋白质、DNADNA及其他生物组分的准确、快速与及其他生物组分的准确、快速与大信息量大信息量的检测。的检测。5.1 生物芯片的分类生物芯片的分类(1)DNA芯片芯片(Gene chip,DNA chip,DNA microarray)(2)蛋白质芯片蛋白质芯片(Protein chip)(3)芯片实验室芯片实验室(Lab-on-a-chip)基因芯片：基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面，是指将大量探针分子固定

15、在物体表面，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和系子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和系列信息。列信息。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因组信息而显示巨大威力。组信息而显示巨大威力。目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变等许多方面。基因、杂交测序、基因突变等许多方面。基因芯片基因芯片蛋白芯片：蛋白芯片：是以蛋白质代替是以蛋白质代替DNA作为检测作为检测对象，比基因芯片更

16、进一步接近生命活动的对象，比基因芯片更进一步接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。应用前景。蛋白芯片蛋白芯片芯片实验室：是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品制备、生化反应和检测分析的全过程集约化，形成微型分析系统。目前，这种形式尚处于研发阶段。芯片实验室芯片实验室5.2 DNA5.2 DNA芯片技术的基本原理芯片技术的基本原理 DNADNA芯片技术的基本原理是分子识别，与芯片技术的基本原理是分子识别，与SouthernSouthern杂交和杂交和NorthernNorthern杂交同出一理，杂交同出一理，即即DNADNA的碱基互补

17、配对和序列互补原理。的碱基互补配对和序列互补原理。据芯片的性能与用途分：据芯片的性能与用途分：1 1）毛细管型微芯片）毛细管型微芯片 2 2）基因探针型微芯片）基因探针型微芯片据据DNADNA芯片上微排列的芯片上微排列的DNADNA不同分：不同分：1 1）寡核苷酸芯片）寡核苷酸芯片 2 2）cDNAcDNA芯片芯片5.3 DNA芯片的类别芯片的类别芯片方阵的构建芯片方阵的构建样品制备样品制备生物分子反应生物分子反应信号的检测及分析信号的检测及分析 5.4 DNA芯片技术流程芯片技术流程 可在基因组水平进行基因表达和发可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等，已方泛现研究、突变、序列测定等，已方泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领域。等多领域。5.5 DNA芯片应用芯片应用Home