实验一 简单染色3.ppt

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1、微生物学实验微生物学实验余雪冰实验一显微镜的使用和细菌的简单染色 实实验验内内容容显微镜介绍油镜的使用原理染色原理实验目的实验目的 实验原理实验原理实验材料实验材料 实验程序实验程序作业作业显微镜的使用细菌简单染色的流程实验目的实验目的了解光学显微镜的构造并掌握其使用方法，重点掌握油镜的使用方法掌握简单染色的原理及方法学习并掌握无菌操作技术实验原理实验原理显微镜介绍显微镜介绍普通光学显微镜普通光学显微镜(NIKON)欧林巴斯（欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜）生物显微镜麦克奥林生物显微镜显显微微镜镜的的构构造造机械装置机械装置光学系统光学系统镜座镜座载物台载物台镜臂镜臂标本夹和标本移动尺标

2、本夹和标本移动尺粗调螺旋和细调螺旋粗调螺旋和细调螺旋聚光镜升降螺旋聚光镜升降螺旋接目镜接目镜接物镜及镜头转换器接物镜及镜头转换器聚光镜聚光镜虹彩光圈虹彩光圈反光镜反光镜显微镜的放大倍数和分辨率显微镜的放大倍数和分辨率1.放大倍数放大倍数=接物镜放大倍数接物镜放大倍数接接目镜放大倍数目镜放大倍数 2.显微镜的分辨率显微镜的分辨率 是表示显微是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：离的能力，可用公式表示为：D=/2nsin(/2)式中式中D D：物镜分辨出物体两点间物镜分辨出物体两点间的最短距离。的最短距离。：可见光的波长（平均可见光的波长（平均

3、0.550.55 m)m)n:n:物镜和被检标本间介质的折物镜和被检标本间介质的折射率。射率。：镜口角（即入射角）。镜口角（即入射角）。实验原理实验原理油镜使用的原理油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。当油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增，则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而加

4、了视野的进光量，从而使物象更加清晰。使物象更加清晰。油浸没物镜油浸没物镜 介质：左空气；右香柏油介质：左空气；右香柏油实验原理实验原理染色剂和染色原理染色剂和染色原理回目录页回目录页由于微生物细胞含有大量水分（一般在由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行

5、观察。但是，任何一项技术都不是完才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、进行的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。渗透、吸附作用等。化

6、学因素如：正负离子之间的相互吸化学因素如：正负离子之间的相互吸引等。引等。实验原理实验原理染色剂和染色原理染色剂和染色原理染色剂染色剂 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：1.酸性染料：酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。2.碱性染料：碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。3.中性（复合）染料：中性（复合）染料：如伊红、美兰等，如伊红、美兰等，Wr

7、ight染料和染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。染料等（常用于细胞核染色）。4.单纯染色：单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b)的染料。的染料。细菌的等电点较低，细菌的等电点较低，pH值大约在值大约在25之间，故在中性、碱性或之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染时染料离子带阳电。因此，带阴电的

8、细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料碱性染料进行染色。进行染色。实验原理实验原理染色剂和染色原理染色剂和染色原理微生物染色常用染料如下表：微生物染色常用染料如下表：实验原理实验原理细菌的三种基本形态细菌的三种基本形态球菌球菌（Spherical coccus）:包括双球菌、链球菌、葡萄球菌、四包括双球菌、链球菌、葡萄球菌、四链球菌、八叠球菌等链球菌、八叠球菌等杆菌杆菌(Rod-shaped bacillus)：短小、粗大、细长、棒状、分支短小、粗大、细长、棒状、分支螺旋菌螺旋菌(Spired-shaped spirallum)：弧菌、螺

9、菌弧菌、螺菌球菌球菌肺炎链球菌肺炎链球菌淋球菌淋球菌化脓性链球菌化脓性链球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus(division)杆菌杆菌破伤风杆菌破伤风杆菌肉毒芽孢杆菌肉毒芽孢杆菌炭疽杆菌炭疽杆菌大肠杆菌大肠杆菌杆菌杆菌变形杆菌变形杆菌大肠杆菌大肠杆菌绿脓杆菌绿脓杆菌螺菌螺菌钩端螺旋体钩端螺旋体幽门螺杆菌幽门螺杆菌霍乱弧菌霍乱弧菌Spirulina sp.-Filamentous Cyanobacterium实验材料实验材料器材器材：显微镜显微镜、擦镜纸、吸水纸、载、擦镜纸、吸水纸、载波片、波片、盖玻片、接种环、酒精灯、废盖玻片、接种环、酒精灯、废液缸、

10、洗瓶液缸、洗瓶等。等。细菌形态的染色标本。细菌形态的染色标本。菌种菌种：大肠杆菌（大肠杆菌（E.coliE.coli）、）、金黄色葡萄球菌染色液和试剂染色液和试剂：吕氏美蓝吕氏美蓝、香柏油、香柏油、二甲苯二甲苯(或者或者乙醇乙醚溶液）等乙醇乙醚溶液）等-实验程序实验程序显微镜的使用显微镜的使用1.用前检查用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。：零件是否齐全，镜头是否清洁。2.调节光亮度调节光亮度 3.低倍镜观察低倍镜观察：粗调、细调：粗调、细调 4.依次再进行依次再进行中倍、高倍观察中倍、高倍观察 5.油镜观察油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标：高倍镜下找到清晰的物象后，提升

11、聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。物象为止。6.换片换片：另换新片，必须从第三条开始操作。：另换新片，必须从第三条开始操作。7.用后复原用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯（或者油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯（或者乙醇乙醚溶液）乙醇乙醚溶液）擦擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。复原。主要是油镜的使用主要是油镜的使用显微镜保养和

12、使用中的注意事项：显微镜保养和使用中的注意事项：1.不准擅自拆卸不准擅自拆卸显微镜的任何部件显微镜的任何部件,以免损坏。以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，用镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，用完油镜必须进行完油镜必须进行“三擦三擦”。3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。免压碎玻片或损伤镜面。4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼

13、睛观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。更不可倾斜拿。6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。实验程序细菌简单染色蒸蒸馏馏水水涂片涂片接接种种环环自然干燥自然干燥固定固定吕吕式式美美兰兰染色染色1min水水洗洗干干燥燥擦拭擦拭水洗时不要直接冲菌膜水洗时不要直接冲菌膜每位学生一人一组，取大肠杆菌和金黄色葡

14、萄球菌，各做一块涂片。每位学生一人一组，取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，各做一块涂片。染色注意事项染色注意事项1.涂片过程中，去生理盐水和细菌不宜过多，涂菌要均匀，不宜过厚涂菌要均匀，不宜过厚。2.固定时温度不可过高，以载玻片背面不烫手背为宜，因为温度过高会破坏细胞的形态温度过高会破坏细胞的形态。3.水洗时，不应直接冲洗细菌涂面，水流不应过大、过急，以免细菌涂面被冲掉以免细菌涂面被冲掉。错误操作示范错误操作示范实验报告实验报告 根据观察结果，画出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，并注明菌体染色后的颜色。绘图的几点要求：绘图要如实反映观察到的情况；图必须要用铅毛绘制；如有要求注明各个构造的名称，须用

15、引线平等引至图的左右侧再行标注；要标出图的名称并注明观察时所用的放大倍数思考题思考题油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？些什么？使用油镜时，为什么必须用镜头油使用油镜时，为什么必须用镜头油？观察微生物不用观察微生物不用油镜头的话，微生物和普通镜头的镜片之间相隔了空油镜头的话，微生物和普通镜头的镜片之间相隔了空气，会因盖玻片折射的光线导致无法得到清晰图像，气，会因盖玻片折射的光线导致无法得到清晰图像，这都是由于微生物体积太小的缘故。所以要用油镜头，这都是由于微生物体积太小的缘故。所以要用油镜头，就是在镜头和盖玻片之间滴上几滴油状有机物，排掉就是在镜头和盖玻片之间滴上几滴油状有机物，排掉空气，容易观察到清晰图像。俗称油镜空气，容易观察到清晰图像。俗称油镜镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？高倍镜或油镜观察？下周实验下周实验实验二实验二 细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色（书中实验十四）（书中实验十四）