第三章 固定化酶.ppt

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1、第三章第三章酶的固定化酶的固定化n第一节第一节 酶的固定化酶的固定化n第二节第二节 辅酶的固定方法辅酶的固定方法n第第三三节节 固定化细胞固定化细胞n第第四四节节 固定化酶的性质及其影响因素固定化酶的性质及其影响因素n第五节第五节 固定化酶催化反应动力学固定化酶催化反应动力学对于现代工业来说，酶不是一种理想的对于现代工业来说，酶不是一种理想的催化剂催化剂n绝大多数绝大多数水溶性的酶水溶性的酶，酶蛋白对，酶蛋白对外界环境很敏感外界环境很敏感，极易失活。催化结束后极易失活。催化结束后极难回收极难回收，只能进行分批，只能进行分批生产。生产。n解决办法解决办法?第一节第一节 酶的固定化酶的固定化n一、

2、固定化酶一、固定化酶（Immobilized Enzyme）n定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收重复使用。重复使用。n固定化酶优点：固定化酶优点：n(1)(1)简化了提纯工艺简化了提纯工艺n(2)(2)可以装塔连续反应可以装塔连续反应n(3)(3)有利于工艺自动化和微电脑化有利于工艺自动化和微电脑化 n(4)(4)多次使用多次使用 n(5)(5)较游离酶相比较游离酶相比能适应于多酶反应能适应于多酶反应 n(6)(6)产品质量高，成本低产品质量高，成本低 n固定化酶缺点：固定化酶

3、缺点：n酶活力有损失酶活力有损失n工厂初始投资大工厂初始投资大n只能用于可溶性底物，只能用于可溶性底物，对大分子底物不适宜对大分子底物不适宜n与完整菌体相比，需与完整菌体相比，需要辅助因子的催化反应要辅助因子的催化反应不适宜于多酶反应不适宜于多酶反应固定化酶的优缺点固定化酶的优缺点固定化酶的制备原则固定化酶的制备原则n必须注意维持酶的催化活性及专一性。必须注意维持酶的催化活性及专一性。n固定化的固定化的载体载体必须有一定的必须有一定的机械强度机械强度 有利于生产自动化，连续化，不能因机械搅拌而破碎或脱落。有利于生产自动化，连续化，不能因机械搅拌而破碎或脱落。n固定化酶应有固定化酶应有最小的空间

4、位阻最小的空间位阻 尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。n酶与载体必须酶与载体必须结合牢固结合牢固 能回收贮藏，反复使用。能回收贮藏，反复使用。n固定化酶应有最大的固定化酶应有最大的稳定性稳定性 所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶的制备原则固定化酶的制备原则n固定化酶应容易与产物分离，固定化酶应容易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可回收和重即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用。复使用。n固定化酶固定化酶成本要低成本要低，以利于工业，以利于工业使用。使用。n充分考虑到

5、固定化酶制备过程充分考虑到固定化酶制备过程和应用过程中的安全因素和应用过程中的安全因素。固定化载体的选择标准载体的形式载体的形式载体的结构载体的结构载体的性质载体的性质酶偶联量酶偶联量或装载量和实效系数二、固定化酶的制备方法二、固定化酶的制备方法 结晶法分散法物理吸附物理吸附法离子结合离子结合法微囊微囊法网格网格法包埋法包埋法化学结合法化学结合法交交 联联 法法共价结合法共价结合法非化学结合法非化学结合法1、物理吸附法(physical adsorption)n是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。性载体的方法。n选择载体的原则选择载体的

6、原则 要有巨大的比表面积 要有活泼的表面 便于装柱进行连续反应。常用的载体有：常用的载体有：n(1)(1)有机载体有机载体：n纤维素纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。n(2)(2)无机载体无机载体：n氧化铅、皂土、白土、高岭土、氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃多孔玻璃、二、二氧化钛等。氧化钛等。n无机载体的吸附容量较低，而且酶容易脱落。无机载体的吸附容量较低，而且酶容易脱落。2、离子结合法(在工业上具广泛的用途在工业上具广泛的用途)n将酶与含有将酶与含有离子交换基团离子交换基团的水的水不溶载体相结合而达到固定化不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。的一种

7、方法。n在在适宜的适宜的pHpH和离子强度和离子强度条件下，条件下，利用酶的侧链解离基团和离子利用酶的侧链解离基团和离子交换基团间的相互作用而达到交换基团间的相互作用而达到酶固定化的方法。酶固定化的方法。n离子交换剂的吸附容量离子交换剂的吸附容量一般大于一般大于物物理吸附剂。理吸附剂。n阴离子交换剂：阴离子交换剂：二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基(DEAE)(DEAE)纤维素、混合胺类纤维素、混合胺类(ECTEDLA)-(ECTEDLA)-纤纤维素、四乙氨基乙基维素、四乙氨基乙基 (TEAE)-(TEAE)-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、AmberliteAmberl

8、ite IRA-93 IRA-93、410410、900900等等。n阳离子交换剂：阳离子交换剂：羧甲基羧甲基(CM)(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、纤维素、纤维素柠檬酸盐、AmberliteAmberlite CG50 CG50、IRC50IRC50、IR200IR200、Dowex-50Dowex-50等。等。19691969年，最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使年，最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂用多糖类阴离子交换剂DEAE-DEAE-SephadexSephadex A-25 A-25固定化的。固定化的。吸附法特点n优点：操作简单操作简单，可供选择

9、的载体类型多，吸附过，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，酶酶活力损失很少活力损失很少。n缺点：酶与载体相互作用力弱导致酶与载体相互作用力弱导致酶易脱落酶易脱落。吸附程度的影响因素吸附程度的影响因素:1.1.pHpH：影响载体和酶的电荷变化影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附从而影响酶吸附2.2.离子强度：离子强度：一般认为盐阻止吸附。一般认为盐阻止吸附。3.3.蛋白质浓

10、度：蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。增加，吸附量也增加，直至饱和。4.4.温度：温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。5.5.吸附速度：吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。小分子慢得多。6.6.载体：载体：非多孔性载体非多孔性载体-颗粒越小吸附力越强。颗粒越小吸附力越强。多孔性载体多孔性载体-要考虑酶的大小和吸附面积的大小。要考虑酶的大小和吸附面积的大小。3 3、包埋法、包埋法 包埋法包埋法是将酶物理是将酶物理包埋在高聚物网格包埋在高聚物

11、网格内的固定化方法。内的固定化方法。如将聚合物的单体和酶溶如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的。固定化的目的。n包括凝胶包埋和微囊化包括凝胶包埋和微囊化包埋两种。包埋两种。(1)(1)凝胶包埋法：凝胶包埋法：n将酶分子包埋在凝胶高聚物网格内的包埋将酶分子包埋在凝胶高聚物网格内的包埋方法。方法。n聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺、海藻酸钠海藻酸钠、K-K-角叉菜胶（卡角叉菜胶（卡拉胶）拉胶）、胶原和明胶胶原和明胶等等 n先把丙烯酰胺单体、交联剂（如先把丙烯酰胺单体、交联剂（如N,

12、N-N,N-甲叉双丙烯甲叉双丙烯酰胺）和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入酰胺）和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化剂（如二甲氨基丙腈与过硫酸钾）使之聚合催化剂（如二甲氨基丙腈与过硫酸钾）使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。物网络。n特点特点:它的机械强度高，在它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到包埋的同时使酶共价偶联到高聚物高聚物上。上。缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺包埋包埋

13、海藻酸钠海藻酸钠 它从海藻中提取出来，可被多价离子它从海藻中提取出来，可被多价离子CaCa2+2+、AlAl3+3+凝胶化凝胶化 ，操作简单经济。，操作简单经济。K-K-角叉莱胶（卡拉胶）角叉莱胶（卡拉胶）卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又称鹿角菜；Cawageen)中提取的一种多糖。可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。(2)(2)微囊化包埋法微囊化包埋法微囊法微囊法主要将酶封装在半透

14、性聚合物膜的微主要将酶封装在半透性聚合物膜的微囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。胶囊和脂质体主要用于医学治疗胶囊和脂质体主要用于医学治疗；中空纤维主要适于工业使用中空纤维主要适于工业使用 。主要包括主要包括（1 1）界面沉淀法）界面沉淀法（2 2）界面聚合法）界面聚合法（3 3）脂质体包埋法）脂质体包埋法 界面沉淀法界面沉淀法 物理微囊化物理微囊化法。它是利用法。它是利用某些高聚物在水相和有机某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很法条件

15、温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。丙烯酸甲酯等。界面聚合法界面聚合法 化学化学方法。方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活发生化学反应而失活。此此法法制制备备的的微微囊囊大大小小能能随随乳乳化化剂剂浓浓度度和和乳乳化化时时的的搅搅拌

16、拌速速度度而而自自由控制，制备过程所需时间非常短。由控制，制备过程所需时间非常短。脂质体包埋法：n由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶埋酶n其特征是底物或产物的膜透过性不依其特征是底物或产物的膜透过性不依辅于膜孔径大小，而只依赖于对膜成辅于膜孔径大小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可加快底物透过膜分的溶解度，因此可加快底物透过膜的速度。的速度。包埋法的包埋法的特特点点n优点优点:反应条件温和、很反应条件温和、很少改变酶结构但是少改变酶结构但是又较牢固。又较牢固。n缺点缺点:只有小分子底物和产物只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩可以通过高聚物网架扩散，对那

17、些底物和产物散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。是大分子的酶并不适合。(适用于脲酶、天冬酰胺酶、适用于脲酶、天冬酰胺酶、过氧化氢酶的固定化过氧化氢酶的固定化)n原因：高聚物网架会对大分原因：高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使定化酶动力学行为改变，使活力降低。活力降低。查资料自学n溶胶溶胶凝胶包埋法凝胶包埋法n前驱体（烷氧基硅烷及其衍生物，如TMOS和TEOS），在液相下将酶、硅源等均匀混合，经水解、缩合反应，溶液形成稳定透明的溶胶体系，溶胶进一步陈化，胶粒间缓慢聚合而形成三维空间网络结构的凝胶，在此过程中凝胶围绕酶分子而将其包埋，网

18、络间充满了受束缚的溶剂，将溶剂进行蒸发、超临界等处理后，即获得固定化酶。4、化学结合法共价结合法n原理原理:酶蛋白分子上的酶蛋白分子上的功能基功能基团团（酶的酶的非活性必需侧非活性必需侧链基团链基团）和固相支持物和固相支持物表面上的表面上的反应基团反应基团之间之间形成共价键，因而将酶形成共价键，因而将酶固定在支持物上固定在支持物上。最常用的偶联基团：最常用的偶联基团：-NH-NH2 2、COOHCOOH、-SH-SH、-OH-OH、酚酚基、咪唑基基、咪唑基两种固定方式两种固定方式1.1.将载体有关基团将载体有关基团 活化，然活化，然后此活泼基团再与酶分子上后此活泼基团再与酶分子上某一基团反应形

19、成共价键。某一基团反应形成共价键。2.2.在载体上接上一个双功能试在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。剂，然后将酶偶联上去。（4）载体活化的方法nA重氮法nB叠氮法nC烷基化反应法nD硅烷化法nE溴化氰法A重氮法n反应示意式如下 A重氮法n目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等n该方法需要载体具有芳香族氨基A重氮法n反应式及原理B 叠氮法n例n用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：n 酯化n 肼解n 叠氮化n(4)偶联B 叠氮法n对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最

20、后与酶偶联 C烷基化反应法n含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。D溴化氰法n本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。E 溴化氰法 共价结合法中的影响因素1.要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。2.偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。3.所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。4.要考虑到酶固定化后的

21、构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。共价结合法的特点n优点优点：n固定化酶结合牢固固定化酶结合牢固n稳定性好稳定性好n利于连续使用利于连续使用n是目前应用和报道最是目前应用和报道最多的一类方法。多的一类方法。n缺点缺点:n载体活化的载体活化的操作复杂，操作复杂，反应条件激烈反应条件激烈，需要严，需要严格控制条件才可以获得格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。较高活力的固定化酶。n会会影响酶的空间构象影响酶的空间构象，从而影响酶的催化活性从而影响酶的催化活性,活力回收率一般较低活力回收率一般较低。4 4、化学结合法交联法交联法利用双功能或多功能试剂利用双功能或多功能试剂在在酶分子间、酶

22、分子与惰酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体性蛋白间或酶分子与载体间间进行进行交交联反应，把酶蛋联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。形成网络结构的固定化酶。n目前常用的交联试剂是目前常用的交联试剂是戊二醛戊二醛。戊二醛戊二醛OHC-(CHOHC-(CH2 2)3 3-CHO-CHO有两个醛基，可与有两个醛基，可与E-NH2生成生成Shiffs碱而使酶蛋白间交联，制成固碱而使酶蛋白间交联，制成固定化酶，交联时的定化酶，交联时的pHpH通常与酶的通常与酶的pIpI相同。相同。n交联法常与吸附法结合使用，或者与交联法常与吸附法结合使用，或者与包

23、埋法配合，目的是使酶紧紧地结合包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合于载体上。于载体上。酶直接交联法酶直接交联法 在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pHpH和离和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。子强度、温度和反应时间之间的平衡。例：木瓜蛋白酶在例：木瓜蛋白酶在0.20.2酶蛋白浓度、酶蛋白浓度、2.32.3戊戊二醛、二醛、pH5.2-7.2pH5.2-7.2、00下交联下交联24h24h，可形成固可形成固定化酶。定化酶。固定化酶制备方法比较固定化酶制备方法比较物理吸附

24、物理吸附离子结合离子结合包埋法包埋法交联法交联法共价共价结合结合法法制备制备易易易易难难难难结合力结合力弱弱强强强强强强酶活力酶活力高高高高中中中中底物专一性底物专一性无变化无变化无变化无变化有有变化变化有变化有变化再生再生可能可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能固定化费用固定化费用低低中中中中高高制法制法特性特性定向固定化l由于酶蛋白多点附着在载由于酶蛋白多点附着在载体上，引起了固定化酶蛋白体上，引起了固定化酶蛋白无序的定向和结构变形的增无序的定向和结构变形的增加。加。l定向固定化技术的优点：定向固定化技术的优点：(1)(1)每一个酶蛋白分子通过其每一个酶蛋白分子通过其一个特定的位点以可

25、重复的一个特定的位点以可重复的方式进行固定化方式进行固定化;(2)(2)有利于进一步研究蛋白有利于进一步研究蛋白质结构质结构;(3)(3)可以借助一个与酶蛋白可以借助一个与酶蛋白的酶活性无关或影响很小的的酶活性无关或影响很小的氨基酸来实现。氨基酸来实现。定向固定化方法酶和抗体的亲和连接酶通过糖基部分固定化酶和金属离子连接分子生物学方法 基因融合法 翻译后修饰法 特定位点基因突变法第二节第二节 辅酶的固定方法辅酶的固定方法n 原因原因n约约1 13 3的酶的催化作用得以进行需要辅酶的参的酶的催化作用得以进行需要辅酶的参与，缺少它们，酶就不能表达其活性与，缺少它们，酶就不能表达其活性 。n在工业上

26、应用全酶的关键是有机辅因子的保留在工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生，因为在反应之后，大多数有机辅因子和再生，因为在反应之后，大多数有机辅因子不能自行再生，其结构往往发生改变。不能自行再生，其结构往往发生改变。n有机辅因子价格昂贵有机辅因子价格昂贵n辅基容易回收n与酶蛋白结合比较牢固，通常可以用超滤膜截留等物理方法进行回收。n辅酶回收再生困难n辅酶分子量小，难以截留再生。n将其与水溶性大分子载体或水不溶性载体结合1.辅基的固定化n过程过程:将活化的载体与连接臂连接，再以适当反应与将活化的载体与连接臂连接，再以适当反应与辅基连接。辅基连接。连接臂连接臂活活化化载载体体辅基辅基功能基团功

27、能基团载体的选择载体的选择n没有特异性吸附没有特异性吸附n具有多孔性具有多孔性n有适合引入配基的官能团有适合引入配基的官能团n化学稳定性化学稳定性n具有适当的机械强度等。具有适当的机械强度等。n目前使用的载体主要是目前使用的载体主要是琼脂糖琼脂糖，此外还有纤维素、玻，此外还有纤维素、玻璃珠及合成高分子材料等。璃珠及合成高分子材料等。连接臂的选择连接臂的选择需考虑的因素需考虑的因素:辅基的性质辅基的性质:疏水性、亲水性、离子性疏水性、亲水性、离子性、体积大小体积大小 长度长度:辅基分子和载体之间需要辅基分子和载体之间需要0.5-1.0 nm 0.5-1.0 nm 长长的手臂。用较长的手臂。用较长

28、的疏的疏水烷基作手臀时，由水烷基作手臀时，由于亦有吸附强的能力、会使固定化辅基吸于亦有吸附强的能力、会使固定化辅基吸附专一性降低。附专一性降低。偶联反应的选择偶联反应的选择n利用辅基分子本身的功能基团与载体连接利用辅基分子本身的功能基团与载体连接 如磷酸吡哆醛如磷酸吡哆醛(胺胺)、FADFAD、FMNFMN、TPPTPP、生物素、生物素、硫辛酸、卟啉等硫辛酸、卟啉等 n 引入适当的功能基团引入适当的功能基团不能影响辅基的活性不能影响辅基的活性 如如羧基羧基或或氨基氨基等等 2.辅酶的固定化n载体共价偶联：与辅基的固定化方法相似n或：修饰后置于超滤器引入一个功能基团，生成辅酶的衍生物引入一个功能

29、基团，生成辅酶的衍生物 羧基或氨基羧基或氨基衍生物再与衍生物再与水溶性高分子聚合物水溶性高分子聚合物结合。结合。选择高分子化选择高分子化 时，要考虑的是高分子化合物的溶解度大、时，要考虑的是高分子化合物的溶解度大、分子大小适当，既能保持在半透膜内，又不会过大地增加分子大小适当，既能保持在半透膜内，又不会过大地增加黏度而影响活性黏度而影响活性。必须将辅酶固定在水溶性载体上辅酶分子量小，难以截留再生，非常致密的超滤膜才能阻止它的流失，这样势必增加流体的流动阻力，降低反应产率。辅酶分子量小，要将其包埋在半透膜比较困难；若将其与水不溶性载体结合，则不能在多个酶之间起传递作用，酶反应存在较大的扩散阻力，

30、酶的表观活力降低，辅酶再生效率降低。n一般引入一般引入羧基羧基的辅酶，用的辅酶，用羰二亚胺羰二亚胺缩合反缩合反应使其与应使其与聚聚LysLys、聚乙亚胺聚乙亚胺结合，形成水溶结合，形成水溶性高分子化合物；性高分子化合物；n引入引入氨基氨基的辅酶，一般用的辅酶，一般用BrCNBrCN活化后，再活化后，再与水溶性多糖类与水溶性多糖类(如如右旋糖苷右旋糖苷)结合，而高结合，而高分子化。分子化。3、辅酶的再生u 除了将辅酶固定在水溶性载体上之外，还需除了将辅酶固定在水溶性载体上之外，还需要有一个适宜的超滤膜反应器或中空纤维反应要有一个适宜的超滤膜反应器或中空纤维反应器来截留固定化辅酶和酶。器来截留固定

31、化辅酶和酶。u 原位再生原位再生将辅因子始终截留在反应体系，将辅因子始终截留在反应体系，通过氧化还原等反应实现辅因子再生。通过氧化还原等反应实现辅因子再生。辅因子再生辅因子再生偶合另一种酶（如醇脱氢酶）偶合另一种酶（如醇脱氢酶）第三节第三节 固定化细胞固定化细胞（Immobilized Cell）n固定化细胞固定化细胞：固定在载体上并在一定的空间范围固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。该细胞能进行正常的生内进行生命活动的细胞。该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。化增殖细胞。n固定化固定化细胞仍保留催

32、化活性并具有能被反复或细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。连续使用的活力。固定化细胞的优缺点n优点：优点：(1)(1)省去了酶的分离手续，为多酶省去了酶的分离手续，为多酶系统，系统，无须辅因子再生无须辅因子再生。(2)(2)细胞生长快且多、反应快细胞生长快且多、反应快(3)(3)可以连续发酵，节约成本，而可以连续发酵，节约成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制边进行培养，排除了产物抑制和消耗。和消耗。(4)(4)保持酶在细胞内的原始状况，保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定增加

33、了酶的稳定性性，特别是对，特别是对污染因子的抵抗力增加。污染因子的抵抗力增加。n缺点：缺点：(1)(1)必须保持菌体的完整，必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。将影响产品纯度。(2)(2)需抑制胞内其他酶的需抑制胞内其他酶的活性，以阻止活性，以阻止副产物副产物的的形成。形成。(3)(3)细胞膜、壁会阻碍底细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。物渗透和扩散。固定化细胞生理状态：固定化细胞生理状态：n固固定定化化死死细细胞胞：一一般般在在固固定定化化之之前前或或之之后后细细胞胞经经过过理理化化方方法法的的处处理理，以以增增加加细细胞胞膜膜的的渗渗透透性性或或抑抑制

34、制副副反反应应，比比较较适于单酶催化的反应。适于单酶催化的反应。n固固定定化化静静止止细细胞胞和和饥饥饿饿细细胞胞：在在固固定定化化之之后后细细胞胞是是活活的的，但是由于采用了控制措施，细胞处于休眠状态或饥饿状态。但是由于采用了控制措施，细胞处于休眠状态或饥饿状态。n固固定定化化增增殖殖细细胞胞：固固定定在在载载体体上上的的活活细细胞胞，在在连连续续反反应应过过程程中中保保持持旺旺盛盛的的生生长长、繁繁殖殖能能力力。更更适适宜宜于于连连续续使使用用，更更适适合合于于进进行行多多酶酶顺顺序序连连续续反反应应，在在发发酵酵工工业业中中最最有有发发展展前途前途。固定化细胞的方法固定化细胞的方法n固定

35、化完整细胞还没有一种理想的通用方法。固定化完整细胞还没有一种理想的通用方法。对于特定的应用，必须找到价格低、简便的方对于特定的应用，必须找到价格低、简便的方法，高的活力和操作稳定性。法，高的活力和操作稳定性。n吸附法：吸附法：条件温和，方法简便，可再生；但吸附条件温和，方法简便，可再生；但吸附力弱，易脱落。力弱，易脱落。n包埋法：包埋法：适合于小分子底物。固定增殖细胞此法适合于小分子底物。固定增殖细胞此法占优势，尤其采用卡拉胶、海藻酸钙等材料更好。占优势，尤其采用卡拉胶、海藻酸钙等材料更好。微生物细胞的固定化微生物细胞的固定化u将基因工程菌固定化后培养可提高基将基因工程菌固定化后培养可提高基因

36、工程菌的稳定性和克隆基因产物的因工程菌的稳定性和克隆基因产物的产量。产量。u基因工程菌的固定化推动了固定化技基因工程菌的固定化推动了固定化技术的发展。术的发展。动植物细胞的固定化动植物细胞的固定化n(一一)植物细胞固定化植物细胞固定化n 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。温和的固定化方法。n一般采用吸附法和包埋法一般采用吸附法和包埋法 n1 1吸附法吸附法 吸附在吸附在泡沫塑料的泡沫塑料的孔孔洞或裂缝洞或裂缝内，或吸附内，或吸附于于中空纤维中空纤维外壁上。外壁上。n用用该该法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化含物法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞

37、进行生产多酚化含物的研究，可连续使用的研究，可连续使用1 1个多月。个多月。n2 2包埋法包埋法 是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。nBrodeliusBrodelius等等(1979)(1979)首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花等细胞。春花等细胞。(二二)动物细胞固定化动物细胞固定化n吸附法吸附法1.转瓶法：转瓶法：2.微载体法：直径微载体法：直径100200um，相对密相对密度近度近1.0的颗粒，表面大，传质好的颗粒，表面大，传质好3.中空纤

38、维法：中空纤维法：包埋法：包埋法：1.凝胶包埋法：凝胶包埋法：琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶、海藻酸钙凝胶、血纤蛋白等。血纤蛋白等。如用一定浓度的海藻酸钙凝胶，与动物细胞如用一定浓度的海藻酸钙凝胶，与动物细胞混合均匀后，用注射器将混合液滴到一定浓混合均匀后，用注射器将混合液滴到一定浓度的度的CaClCaCl2 2溶液中即可。溶液中即可。2.2.半透膜包埋法：半透膜包埋法：海藻酸钙海藻酸钙-聚赖氨酸（聚赖氨酸（ALG-ALG-PLLPLL）包埋技术。）包埋技术。(三)原生质体固定化n微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后，可获得原生质体，增加胞内物质的分泌。n固定化原生质体：原生质体用多孔凝胶包

39、埋，稳定性提高，可免至破裂。也有利于氧传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。原生质体的制备收集对数生长期的细胞，悬浮在含有渗透压收集对数生长期的细胞，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中；稳定剂的高渗缓冲液中；加入适宜的细胞壁水解酶加入适宜的细胞壁水解酶;分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶，得到原生质体。胞壁水解酶，得到原生质体。u把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。悬浮液，

40、然后采用包埋法制成固定化原生质体。固定化酶应用实例固定化酶和固定化细胞固定化酶和固定化细胞应用应用生产时间生产时间氨基酰氨基酰化化酶酶DL-DL-氨基酸的氨基酸的拆分拆分1969葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶将葡萄糖异构变为果糖将葡萄糖异构变为果糖1973青霉素酰青霉素酰化化酶酶生产生产6-APA6-APA1973天冬氨酸酶天冬氨酸酶生产生产L-L-天冬氨酸天冬氨酸1973延胡索酸酶延胡索酸酶生产生产L-L-苹果酸苹果酸1974-半乳糖苷酶半乳糖苷酶水解乳糖水解乳糖1977L-L-天冬氨酸天冬氨酸-脱羧酶脱羧酶生产生产L-L-丙氨酸丙氨酸1982第第四四节节 固定化酶的性质及其影响因素固定化酶的性质

41、及其影响因素一、影响固定化酶（细胞）性质的因素影响固定化酶（细胞）性质的因素1 1酶本身的变化：酶本身的变化：活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。2 2载体的影响载体的影响3.3.固定化方法的影响固定化方法的影响 分配效应分配效应 空间障碍效应空间障碍效应 扩散限制效应扩散限制效应 由于载体和底物的性质差由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。境之间的性质不同。微环境微环境是在固定化酶附近是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶的局部环境，而将主体溶液称为液称为宏观环境宏观环境。由这种。由这种不同造成的不同造成的底物、产物和底物、产物

42、和各种效应物在两个环境之各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分间的不同分配，被称为分配效应。配效应。分配效应分配效应 空间障碍效应空间障碍效应 固定化之后，由于酶的空间自由度受到限固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使，使酶分子的活性基团不易与底物或效应物接触，酶分子的活性基团不易与底物或效应物接触，影响酶分子的活性中心对底物的定位作用影响酶分子的活性中心对底物的定位作用,所造所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空成的对固定化

43、酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。间障碍效应。酶固定化使生物催化反应从均相转化为多酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力相，于是产生了扩散阻力：1 1）外扩散阻力）外扩散阻力是底物是底物从宏观环境向酶颗粒从宏观环境向酶颗粒表表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。少外扩散效应。扩散限制效应

44、扩散限制效应内扩散阻力内扩散阻力2 2）内扩散阻力）内扩散阻力是指底物分子达到是指底物分子达到固相酶表固相酶表面面后传递到后传递到酶活性部位酶活性部位时的一种扩散阻力，时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的载体小而弯曲的细孔细孔是产生内扩散阻是产生内扩散阻力的主要原因。因此使用低分子量底物，力的主要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。低这种内扩散阻力。1 1、固定化酶的活力在大多数情况下比固定化酶的活力在

45、大多数情况下比天然酶下降天然酶下降，其，其专一性也会受到影响发生改变。专一性也会受到影响发生改变。活力下降的原因：活力下降的原因：酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。固定化后的空间障碍效应的影响。固定化后的空间障碍效应的影响。内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。受阻。包埋法时被高分子物质半透膜包围。包埋法时被高分子物质半透膜包围。二、二、固定化酶（细胞）性质的固定化酶（细胞）性质的改变改变 2 2、固定化后酶稳定性提高

46、、固定化后酶稳定性提高稳定性提高的表现：稳定性提高的表现：n热稳定性提高：耐热性提高，最适温度提高，酶催化反应能在较高温度下进行。n对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高：使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。n固定化酶对不同pH(酸度)稳定性、对蛋白酶稳定性、贮存稳定性和操作稳定性都有影响。举例:n氨基酰化酶溶液酶在氨基酰化酶溶液酶在7575，15min15min，失活；，失活；DEAE-DEAE-SephadexSephadex固定化酶在同样条件下仍有固定化酶在同样条件下仍有8080；DEAE-DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有纤维素固定化酶在同样条件下还有60%60%活力。活力

47、。n氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存2020，而将其固定于而将其固定于DEAE-DEAE-纤维素上在同样条件下仍纤维素上在同样条件下仍有有8080的活力。的活力。n固定化木瓜蛋白酶固定化木瓜蛋白酶(琼脂琼脂)在在44下，下，120120天酶活天酶活力无变化。力无变化。稳定性提高的原因：n固定化后的酶与载体多点连接固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子，可防止酶分子伸展变形。增加了酶活性构象的牢固程度。伸展变形。增加了酶活性构象的牢固程度。n酶活力的缓慢释放。酶活力的缓慢释放。n抑制酶的自身降解。抑制酶的自身降解。酶与载体结合后失去了分酶与载体结合后失去了分

48、子间相互作用的机会，抑制了其自身的降解过子间相互作用的机会，抑制了其自身的降解过程。程。n固定化部分一定程度上阻挡了外界不利因素对固定化部分一定程度上阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。酶的侵袭。3 3、固定化酶（细胞）的作用、固定化酶（细胞）的作用pHpH变化变化 酶固定化后，对底物的最适酶固定化后，对底物的最适pHpH曲线常常发生偏曲线常常发生偏移。移。一般来说，一般来说，带负电荷载体带负电荷载体制备的固定化酶，其制备的固定化酶，其最适最适pHpH值较游离酶偏高值较游离酶偏高，这是因为多聚阴离子载，这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液中阳离子，包括体会吸引溶液中阳离子，包括H+H+，使其附着于载使其

49、附着于载体表面，结果使固定化酶扩散层体表面，结果使固定化酶扩散层H+H+浓度比周围的浓度比周围的外部溶液高，即偏酸，这样外部溶液中的外部溶液高，即偏酸，这样外部溶液中的pHpH必须必须向碱性偏移，才能抵消微环境作用，使其表现出向碱性偏移，才能抵消微环境作用，使其表现出酶的最大活力。酶的最大活力。反之，若使用反之，若使用带正电荷载体带正电荷载体的话，其的话，其最适最适pHpH值较值较游离酶偏低游离酶偏低，即向酸性偏移。，即向酸性偏移。4 4、固定化酶（细胞）的最适温度的变化、固定化酶（细胞）的最适温度的变化 酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因

50、为固定化后，酶的热稳定性度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以提高，所以最适温度也随之提高最适温度也随之提高，这是很有利，这是很有利的结果。的结果。5 5、米氏常数米氏常数KmKm的变化的变化 固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数K Km m随载体的带电性随载体的带电性能变化。能变化。由于高级结构变化及载体影响引起由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物酶与底物亲和力变化亲和力变化，从而，从而使使K Km m变化。而这种变化。而这种K Km m变化又受变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高，载体周到溶液中离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，围的静电梯度