核酸凝胶电泳.ppt

《核酸凝胶电泳.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸凝胶电泳.ppt（9页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 核酸凝胶电泳核酸凝胶电泳 引言：引言：核酸是带均匀负电荷的生物大分子，核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、较大差异，达到分离的目的。此为

2、分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯）进行染色，可直接在紫外灯下确定下确定DNA在凝胶中的位置。在凝胶中的位置。影响核酸电泳的因素：影响核酸电泳的因素：1核酸的性质核酸的性质 2凝胶孔径的大小凝胶孔径的大小 3电场强度和电场方向电场强度和电场方向 4电泳环境电泳环境 缓冲液的组成和离子强度缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。直接影响迁移率。核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种：核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚蓝溴酚蓝 二甲苯青，二甲苯青，DNADNA的

3、琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 引言：琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，引言：琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。对对DNA电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化，主要用于变化，主要用于DNA的限制酶原位消化、的限制酶原位消化、DNA片段回片段回收以及小收以及小DNA片段（片

4、段（10500 bP）的分离。琼脂糖）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。【实验目的实验目的】掌握掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和琼脂糖凝胶电泳的原理和操作方法。操作方法。【实验原理实验原理】DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，分子，其电场中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比，其电场中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比，电泳时加

5、溴化乙锭，其与电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合结合形成一种荧光络合物，在物，在254365 nm紫外光照射下可产生桔红色的荧紫外光照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测光，可用于检测DNA（此法可观察到凝胶中（此法可观察到凝胶中2 ng的的DNA）。如有必要可从凝胶回收）。如有必要可从凝胶回收DNA片段，用于分子片段，用于分子克隆或探针标记等操作。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，克隆或探针标记等操作。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离分离DNA的范围广，约的范围广，约200 bp50 kb。【实验材料实验材料】1电泳仪。电泳仪。2电泳槽。电泳槽。3紫外透射仪。紫外透射仪。4试剂试剂【实

6、验方法实验方法】1琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶板的制备 将将12%琼脂糖凝胶加热溶化均琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到匀，冷却到6070加加EB至浓度至浓度0.5 g/ml，倒入封好，倒入封好的凝胶槽，厚度约的凝胶槽，厚度约35 mm，在距底板，在距底板0.51 mm的位的位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，可用吸管小心吸置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，可用吸管小心吸出气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽出气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶中，缓冲液淹没过胶12 mm为止。为止。2加样加样 样品中加样品中加1/5体积的上样缓冲液，混匀，取体积的上

7、样缓冲液，混匀，取1015 l加入凝胶点样孔中，同时要设立合适的加入凝胶点样孔中，同时要设立合适的DNA相对分相对分子质量标准物。子质量标准物。3电泳电泳 电压电压10 V/cm，电泳至溴酚蓝移出样品槽到，电泳至溴酚蓝移出样品槽到凝胶板的凝胶板的2/3距离时，关闭电源。距离时，关闭电源。4取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色红色DNA区带。【实验思考实验思考】1影响影响DNA片段琼脂糖电泳有哪几个片段琼脂糖电泳有哪几个因素？操作因素？操作DNA琼脂糖凝胶电泳时为何琼脂糖凝胶电泳时为何要戴手套？要戴手套？2DNA片段琼脂糖电泳操作应注意哪片段琼脂糖电泳操作应注意哪些问题？些问题？