离子交换层析.ppt

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1、离子交换层析离子交换层析概述：概述：用于生物大分子物质如酶、蛋白质、多肽、核酸、用于生物大分子物质如酶、蛋白质、多肽、核酸、寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖的分离和纯化。寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖的分离和纯化。特点：特点：具有开放性支持骨架具有开放性支持骨架 具亲水性具亲水性 多孔性多孔性.离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的离的各种离子结合力的差异差异，而将混合物中不同离子，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。进行分离的层析技术。一

2、一.离子交换剂离子交换剂:在惰性载体上引入在惰性载体上引入(以共价结合的方式以共价结合的方式)带有电荷的带有电荷的活性基团活性基团.1.按其带电荷的功能基团分类按其带电荷的功能基团分类(1)阳离子交换剂阳离子交换剂:载体上带有载体上带有负电荷负电荷的功能基团的功能基团,能结合溶液中的正电能结合溶液中的正电荷荷.(2)阴离子交换剂阴离子交换剂:载体上带有载体上带有正电荷正电荷的功能基团的功能基团,能结合溶液中的负电能结合溶液中的负电荷荷.2.按其载体分类按其载体分类(1)离子交换树脂离子交换树脂:主要有聚苯乙烯型树脂和聚酚型树脂主要有聚苯乙烯型树脂和聚酚型树脂.聚苯乙烯树脂由苯乙烯和二乙烯苯聚合

3、而成一网状聚苯乙烯树脂由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成一网状结构结构.交联剂交联剂:二乙烯苯二乙烯苯 二乙烯苯二乙烯苯交联度交联度=100%苯乙烯苯乙烯+二乙烯苯二乙烯苯苯乙烯和二乙烯苯混合成不同的比例就可获得不同交苯乙烯和二乙烯苯混合成不同的比例就可获得不同交联度的树脂联度的树脂.二乙烯苯相对于苯乙烯的量越大二乙烯苯相对于苯乙烯的量越大,获得的树脂交联度就获得的树脂交联度就越大越大.交联度大的树脂结构紧密、孔隙小交联度大的树脂结构紧密、孔隙小,大分子量的离子就大分子量的离子就不能进入树脂颗粒内发生离子交换不能进入树脂颗粒内发生离子交换.交联度的范围从交联度的范围从1%16%树脂所含的交换基团性质分

4、为两类树脂所含的交换基团性质分为两类:a.阳离子交换树脂阳离子交换树脂:能与溶液中阳离子交换能与溶液中阳离子交换,树脂带树脂带负电荷负电荷.b.阴离子交换树脂阴离子交换树脂:能与溶液中阴离子交换能与溶液中阴离子交换,树脂带树脂带正电荷正电荷.根据阳离子和阴离子交换树脂中功能基团的酸碱解离根据阳离子和阴离子交换树脂中功能基团的酸碱解离程度分为强、弱两种程度分为强、弱两种:(a)强酸型阳离子交换树脂强酸型阳离子交换树脂:主要以磺酸基主要以磺酸基(R-SO3)为功能基团为功能基团,它的解离不受外它的解离不受外界溶液的影响界溶液的影响.典型的交换方程式典型的交换方程式:RSO3H+NaCl RSO3N

5、a+HCl(b)弱酸型阳离子交换树脂弱酸型阳离子交换树脂:功能基团为羧基功能基团为羧基(-COOH)、酚羟基等、酚羟基等,它们解离程它们解离程度小度小,交换性能和溶液的交换性能和溶液的pH有关有关,在酸性溶液中无交换在酸性溶液中无交换作用作用.典型交换方程式典型交换方程式:RCOOH+NaOH RCOONa+H2O(c)强碱型阴离子交换树脂强碱型阴离子交换树脂:功能基团含三甲胺的称为强碱功能基团含三甲胺的称为强碱 I 型型,含二甲基乙醇胺含二甲基乙醇胺称为强碱称为强碱 II 型型.pH条件都不受限制条件都不受限制.典型交换方程式典型交换方程式:RN(CH3)3+NaOH RN(CH3)3OH+

6、NaCl(d)弱碱型阴离子交换树脂弱碱型阴离子交换树脂 以伯胺基以伯胺基(-NH)、仲胺基、仲胺基(NH)、叔胺基、叔胺基(N)或或吡啶基为功能基团吡啶基为功能基团,交换能力随溶液的交换能力随溶液的pH条件而变化条件而变化,pH越低交换能力越强越低交换能力越强.典型交换方程式典型交换方程式:RNH3OH +HCl RNH3Cl+H2O 离子交换树脂指标离子交换树脂指标:交联度、交换容量交联度、交换容量a.交联度交联度:交联剂所占的百分比称为交联度交联剂所占的百分比称为交联度.范围从范围从1%16%.交联度小交联度小,分子结分子结 构较疏松构较疏松,孔径大适孔径大适用于用于 分离分子分离分子 量

7、较大的离子性物质量较大的离子性物质.交联度大交联度大,孔径孔径 小适用分离分子量小的物质小适用分离分子量小的物质.目数目数：离子交换树脂的颗粒直径大小：离子交换树脂的颗粒直径大小 Dowex 50 为为20-50目目 20 840 m 50 297 m 100 149 m （代表二乙烯苯的百分含量）（代表二乙烯苯的百分含量）b.交换容量交换容量:指树脂能进行交换的能力指树脂能进行交换的能力,主要决定于树主要决定于树 脂网状脂网状结构内所结构内所 含的碱性或酸性基团的数目含的碱性或酸性基团的数目.以以mmol/ml 或或 mmol/g 表之表之.(2)纤维素离子交换剂纤维素离子交换剂:在纤维素分

8、子结构上连接一定的离子交换基团就在纤维素分子结构上连接一定的离子交换基团就成为离子交换纤维素成为离子交换纤维素.(3)离子交换凝胶离子交换凝胶 分离大分子物质分离大分子物质 如如:葡聚糖离子交换剂、琼脂糖离子交换剂、聚丙烯葡聚糖离子交换剂、琼脂糖离子交换剂、聚丙烯酰胺离子交换剂酰胺离子交换剂.二二.原理原理 离子交换层析是以离子交换层析是以离子交换剂离子交换剂(具有离子交换性能具有离子交换性能的物质的物质)作为作为固定相固定相,利用它与利用它与流动相流动相(洗脱剂洗脱剂)中的中的离子离子能进行能进行可逆交换可逆交换的性质的性质,来分离离子型化合物的一种方来分离离子型化合物的一种方法法.即溶液中

9、的即溶液中的离子离子与离子交换剂上的与离子交换剂上的功能基团功能基团交换反应的交换反应的过程过程.离子交换过程示意：离子交换过程示意：起始起始 吸附吸附 解吸解吸 完成完成 x+:起始缓冲离子起始缓冲离子 y+：待分离离子：待分离离子 z+：待分离离子：待分离离子 带电荷量少带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来亲和力小的先被洗脱下来;带电荷量带电荷量多多,亲和力大的后被洗脱下来亲和力大的后被洗脱下来.三三.操作注意点操作注意点:1.离子交换剂的选择离子交换剂的选择:选择原则选择原则:根据被分离物质的性质选择根据被分离物质的性质选择 同一性质离同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间子交换剂

10、中选用对被分离物质各组分之间结合力差异结合力差异大大的型号的交换剂的型号的交换剂.考虑因素考虑因素:1.被分离物质所带的电荷被分离物质所带的电荷.2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小.3.被分离物质所处的环境被分离物质所处的环境.4.被分离物质的物理化学性质被分离物质的物理化学性质.5.被分离物质的大概数量被分离物质的大概数量.(二二)缓冲液的选择缓冲液的选择:原则原则:不能发生化学反应不能发生化学反应,避免使样品发生避免使样品发生 变性变性.考虑因素考虑因素:1.1.被分离物质的稳定性被分离物质的稳定性.蛋白质的大分子物质在层析时不发生变性蛋白质的大分子物质在层析时不发生变性.2.2

11、.在此缓冲溶液的在此缓冲溶液的pHpH条件下条件下,被分离物质所带的被分离物质所带的 电荷性质与交换剂上的平衡离子相等电荷性质与交换剂上的平衡离子相等.3.3.离子交换剂的性质离子交换剂的性质.避免缓冲离子与交换剂上的离子发生交换避免缓冲离子与交换剂上的离子发生交换,引起引起pHpH变化变化,降低交换容量降低交换容量.4.4.缓冲液必须不影响被分离物质的测定缓冲液必须不影响被分离物质的测定.(三三)洗脱剂的选择洗脱剂的选择:原则原则:所用洗脱液比吸附物质具有更活泼的离子或基团所用洗脱液比吸附物质具有更活泼的离子或基团,改变溶液的改变溶液的 pH 或离子强度或离子强度*增强洗脱液与离子交换剂的结

12、和力增强洗脱液与离子交换剂的结和力*降低待分离物与离子交换剂的结合力降低待分离物与离子交换剂的结合力洗脱方式洗脱方式:梯度洗脱梯度洗脱离子交换层析分离氨基酸及其测定离子交换层析分离氨基酸及其测定(一一)原理原理 氨基酸是两性电解质，各有一定的等电点（氨基酸是两性电解质，各有一定的等电点（pIpI）。）。在溶液在溶液 pH pH 小于其小于其 pI pI 值时均带正电荷，反之则带负值时均带正电荷，反之则带负电荷。本实验所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液，电荷。本实验所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液，分别属于酸性氨基酸（分别属于酸性氨基酸（pI 2.97pI 2.97）和碱性氨基酸（）和碱性氨基

13、酸（pI pI 9.749.74）。在）。在pH 4.2pH 4.2柠檬酸钠缓冲液中，天冬氨酸、赖柠檬酸钠缓冲液中，天冬氨酸、赖氨酸各带有负电荷和正电荷。以强酸型氨酸各带有负电荷和正电荷。以强酸型阳离阳离子子交换树脂交换树脂 Dowex 50为固定相，由于天冬氨酸为固定相，由于天冬氨酸在在 pH 4.2 pH 4.2 柠檬酸钠缓冲液中柠檬酸钠缓冲液中带负电荷不与树脂结合，带负电荷不与树脂结合，首先被洗脱出来。赖氨酸带正电荷，与树脂紧密结合首先被洗脱出来。赖氨酸带正电荷，与树脂紧密结合而不被洗脱。随后再通过改变洗脱液的而不被洗脱。随后再通过改变洗脱液的 pH pH 值，降低赖值，降低赖氨酸与树脂

14、的亲和力而将赖氨酸从树脂中洗脱出来。氨酸与树脂的亲和力而将赖氨酸从树脂中洗脱出来。氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物。因此可将氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物。因此可将收集到的水溶液与茚三酮试剂反应，观察其是否生成收集到的水溶液与茚三酮试剂反应，观察其是否生成蓝紫色化合物而判断洗脱情况，并可通过比色定量蓝紫色化合物而判断洗脱情况，并可通过比色定量.(二二)试剂试剂1.1.离子交换树脂离子交换树脂 Dowex 50 型型 Dowex 50 为强酸型阳离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂.颗粒直径颗粒直径 297m，以带负电荷的，以带负电荷的磺酸基磺酸基团（团（SO SO3 3H H）为功能基）为

15、功能基团，它的解离不受外界溶液团，它的解离不受外界溶液 pH pH 的影响。磺酸基团能的影响。磺酸基团能够与带正电荷的阳离子发生可逆的离子交换反应。够与带正电荷的阳离子发生可逆的离子交换反应。2.2.洗脱液洗脱液（1 1）pH 4.2 pH 4.2 柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液 天冬氨酸天冬氨酸 pI 2.97 pI 2.97 pH 4.2 pH 4.2 柠檬酸钠缓冲柠檬酸钠缓冲液带负电荷。液带负电荷。赖氨酸赖氨酸 pI 9.74 pI 9.74 pH 4.2 pH 4.2 柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液带正电荷带正电荷。(2)0.1 mol/L NaOH 改变洗脱体系的改变洗脱体系的pHpH值

16、，使本与树脂结合的赖氨值，使本与树脂结合的赖氨 酸带上负电荷，从而被洗脱下来。酸带上负电荷，从而被洗脱下来。3.3.样品混合液样品混合液 称取天冬氨酸、赖氨酸各称取天冬氨酸、赖氨酸各10 10 mg 溶于溶于10 10 ml pH4.2 pH4.2 柠檬酸钠缓冲液中。柠檬酸钠缓冲液中。4.茚三酮显色液 氨基酚与茚三酮反应显色以检测氨基酸洗脱情况。(三)操作1.层析：将Dowex50装柱后，用0.1mol/L NaOH清洗树脂5分钟。再用pH4.2柠檬酸缓冲液平衡10分钟。（方法同凝胶层析法）加样8滴。当样品进入树脂后，加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集，每管收集3ml（控制流速15滴/分钟）。当第一峰一出现，换用0.1mol/L NaOH作洗脱液，直至第二峰收集完毕。用pH4.2缓冲液再平衡10分钟，再生。2 2、检检测测：从从第第2管管起起每每收收集集管管中中加加入入2.0 ml茚茚三三酮酮显显色色液液，充充分分混混合合，沸沸水水浴浴1015分分钟钟，自自来来水水冷冷却却，观观察察氨氨基基酸酸与与茚茚三三酮酮的的显显色色反反应应，若若生生成成紫紫色色化化合合物物，则则说说明收集到氨基酸。明收集到氨基酸。