原位杂交.ppt

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1、in situ hybridization彭景楩彭景楩E-mail：Tel:64807183核酸核酸mRNA、DNA蛋白质蛋白质RT-PCRRealtimePCRNorthernblot（RNA）Southernblot（DNA）原位杂交原位杂交指纹分析指纹分析（Finger printing）基因芯片基因芯片（DNA microarray）ELISAWesthernblot免疫组化免疫组化背背 景景主要内容主要内容1.定义、基本概念和发展简史定义、基本概念和发展简史2.原位杂交的基本原理原位杂交的基本原理3.探针探针(probe)与探针的标记物与探针的标记物4.探针标记法与探针的纯化探针标记

2、法与探针的纯化5.探针制备技术探针制备技术6.核酸分子杂交信号的检测核酸分子杂交信号的检测7.地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法原位杂交组织化学（原位杂交组织化学（ISHHISHH）简称原位杂交）简称原位杂交是将是将分子杂交分子杂交与与组织化学组织化学相结合的一项技术相结合的一项技术在原位检测组织、细胞中的特定核酸序列在原位检测组织、细胞中的特定核酸序列定义核核酸酸原原位位杂杂交交技技术术：利利用用放放射射性性或或非非放放射射性性标标记记的的已已知知核核酸酸探探针针，通通过过放放射射自自显显影影或或非非放放射射检检测测系系统统检检测测组组织织、细细胞胞及及

3、染染色色体体上上特特异异DNADNA或或RNARNA序列的一种技术，序列的一种技术，一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法杂交双方：杂交双方：待测核酸序列、核酸探针待测核酸序列、核酸探针待待测测核核酸酸序序列列：克克隆隆的的基基因因片片段段，未未克克隆隆化化的的基基因因组组DNADNA和和细细胞胞 总总RNARNA。核核酸酸探探针针：用用放放射射性性同同位位素素、非非放放射射性性荧荧光光染染料料直直接接或或间间接接标标记记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNADNA或或RNARNA片段。片段。分为分为

4、cDNAcDNA探针、基因组探针、基因组DNADNA探针、寡核苷酸探针、探针、寡核苷酸探针、RNARNA探针等。探针等。基本概念分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交(简称杂交简称杂交简称杂交简称杂交,hybridization),hybridization)就是应用核酸分子的变性和复性的就是应用核酸分子的变性和复性的就是应用核酸分子的变性和复性的就是应用核酸分子的变性和复性的性质性质性质性质,使来源不同的使来源不同的使来源不同的使来源不同的DNA(DNA(或或或或RNA)RNA)片段片段片段片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子。按碱基互补关系形成杂交双链分子。按碱基互补关系形成杂交双链分子。按碱基

5、互补关系形成杂交双链分子。分子杂交分子杂交原位杂交原位杂交将将将将特特特特定定定定标标标标记记记记的的的的已已已已知知知知顺顺顺顺序序序序核核核核酸酸酸酸为为为为探探探探针针针针与与与与细细细细胞胞胞胞或或或或组组组组织织织织切切切切片片片片中中中中核核核核酸酸酸酸进进进进行行行行杂杂杂杂交交交交，从从从从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。是是是是指指指指带带带带有有有有某某某某些些些些标标标标记记记记物物物物(如如如如放放放放射射射射性性性性同同同同位位位位素素素素3

6、2P32P，异异异异硫硫硫硫氰氰氰氰酸酸酸酸荧荧荧荧光光光光素素素素等等等等)的的的的特特特特异异异异性性性性核核核核酸酸酸酸序序序序列列列列片片片片段段段段。设设设设法法法法使使使使一一一一个个个个核核核核酸酸酸酸序序序序列列列列带带带带上上上上32P32P，那那那那么么么么它它它它与与与与靶靶靶靶序序序序列列列列互互互互补补补补形形形形成成成成的杂交双链，就会带有放射性。的杂交双链，就会带有放射性。的杂交双链，就会带有放射性。的杂交双链，就会带有放射性。探探 针针 核核核核酸酸酸酸分分分分子子子子杂杂杂杂交交交交：按按按按照照照照碱碱碱碱基基基基互互互互补补补补配配配配对对对对原原原原则则

7、则则，将将将将不不不不同同同同来来来来源源源源的的的的序序序序列列列列互互互互补补补补单单单单链链链链的的的的DNA/DNADNA/DNADNA/DNADNA/DNA，RNA/RNARNA/RNARNA/RNARNA/RNA，RNA/DNARNA/DNARNA/DNARNA/DNA，互互互互补补补补配配配配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行原位杂交：用核苷酸探

8、针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行 杂交杂交杂交杂交,叫原位杂交。可用于叫原位杂交。可用于叫原位杂交。可用于叫原位杂交。可用于DNADNADNADNA、RNARNARNARNA定位研究。定位研究。定位研究。定位研究。反义技术反义技术反义技术反义技术 主要是引入目的基因主要是引入目的基因主要是引入目的基因主要是引入目的基因mRNAmRNAmRNAmRNA的反义序列或与目的基因的反义序列或与目的基因的反义序列或与目的基因的反义序列或与目的基因互补配对的反义基因，通互补配对的反义基因，通互补配对的反义基因，通互补配对的反义基因，通过它们的杂交而阻遏或

9、降过它们的杂交而阻遏或降过它们的杂交而阻遏或降过它们的杂交而阻遏或降低目的基因表达的一种方低目的基因表达的一种方低目的基因表达的一种方低目的基因表达的一种方法。当引入的反义核酸与法。当引入的反义核酸与法。当引入的反义核酸与法。当引入的反义核酸与相应序列互补配对后，用相应序列互补配对后，用相应序列互补配对后，用相应序列互补配对后，用于表达目的基因的于表达目的基因的于表达目的基因的于表达目的基因的mRNAmRNAmRNAmRNA量量量量大大减少，使细胞中靶基大大减少，使细胞中靶基大大减少，使细胞中靶基大大减少，使细胞中靶基因编码的蛋白合成量也大因编码的蛋白合成量也大因编码的蛋白合成量也大因编码的蛋

10、白合成量也大为减少为减少为减少为减少DNA/RNA核酸分子杂交核酸分子杂交DNA印迹技术印迹技术(Southern blotting)用于用于基因组基因组DNA的定性定量分析、酶切图谱分析、基因的定性定量分析、酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析（突变分析及限制性片段长度多态性分析（RFLP）等。）等。蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNA的定性定量分析。靶核酸是的定性定量分析。靶核酸是RNA；电泳时，；电泳

11、时，凝胶中加入变性剂，防止凝胶中加入变性剂，防止RNA分子形成二级结构分子形成二级结构发展简史发展简史 19691969年，美国耶鲁大学年，美国耶鲁大学年，美国耶鲁大学年，美国耶鲁大学GallGall和和和和ParduePardue首先创立，用首先创立，用首先创立，用首先创立，用 爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。19711971年，年，年，年，Jac

12、ob Jacob 创立电镜原位杂交技术检测爪创立电镜原位杂交技术检测爪创立电镜原位杂交技术检测爪创立电镜原位杂交技术检测爪 蟾卵母细胞蟾卵母细胞蟾卵母细胞蟾卵母细胞DNADNA 80 80 80 80年代，原位杂交技术飞速发展年代，原位杂交技术飞速发展年代，原位杂交技术飞速发展年代，原位杂交技术飞速发展 现已能检测只有数百碱基对的较小分子现已能检测只有数百碱基对的较小分子现已能检测只有数百碱基对的较小分子现已能检测只有数百碱基对的较小分子 DNADNA和含量很低的和含量很低的和含量很低的和含量很低的mRNAmRNA 当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细

13、胞，探 针均采用针均采用同位素同位素标记。标记。同位素标记缺点：污染环境，有害人体，半衰期局同位素标记缺点：污染环境，有害人体，半衰期局 限性限性19811981，Bauman等首先应用荧光素标记等首先应用荧光素标记cRNA探针探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功荧光杂交技术荧光杂交技术。19821982，ShroyerShroyer报道用报道用2 2，4 4二硝基苯甲醛（二硝基苯甲醛（DNPDNP）标记标记DNADNA探针，使该探针，使该DNADNA探针具有抗原性，然后用探针具有抗原性，然后用兔抗兔抗DNPDNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经

14、的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫免疫过氧化物酶的方法过氧化物酶的方法来定位杂交探针来定位杂交探针 上述两种方法敏感度不高，应用不够普遍。上述两种方法敏感度不高，应用不够普遍。发展简史发展简史生生物物素素标标记记探探针针技技术术是是BrigatBrigat（19831983）首首先先建建立立的的，它它利利用用生生物物素素标标记记的的探探针针在在组组织织切切片片上上检检测测了了病病毒毒DNADNA，通通过过生生物物素素与与抗抗生生物物素素结结合合，过过氧氧化化物物酶酶-抗抗过过氧氧化化物物酶酶显显示示系系统统显显示示病病毒毒DNADNA在在细细胞胞中中的的定位。定位。生生物物素素标标记记探探针

15、针技技术术目目前前已已被被广广泛泛应应用用酶促生物素标记技术酶促生物素标记技术发展简史发展简史19871987年年 PezzellaPezzella用用磺磺基基化化DNADNA探探针针，以以单单克克隆隆抗抗体体识识别别磺磺基基化化探探针针，通通过过免免疫疫组组化化显显示示结结合合的单克隆抗体，对杂交结合探针定位。的单克隆抗体，对杂交结合探针定位。优点：探针标记简便，不需作切片平移标记，优点：探针标记简便，不需作切片平移标记，敏感度较高。敏感度较高。发展简史发展简史19871987年年，将将地地高高辛辛标标记记的的有有关关试试剂剂及及药药盒盒投投放放市市场场。地地高高辛辛标标记记技技术术引引起起

16、科科技技工作者的极大兴趣。工作者的极大兴趣。标记标记碱性磷酸酶碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶显色显色 优优点点：完完全全、方方便便、省省时时，敏敏感感性性和和质质量量控控制制较较好好，可可检检测测人人基基因因组组DNADNA的的单单拷拷贝基因，背景反差好。贝基因，背景反差好。发展简史发展简史19911991年年 CoutonCouton建建立立将将非非放放射射性性标标记记技技术术更更新新为为亲亲和和复复合合物物标标记记技技术术 （Affinity-complex Affinity-complex LabelledLabelled ProbesProbes，ACLPACLP）。）。发发展展趋

17、趋势势：实实验验室室常常规规技技术术和和临临床床日日常常应用的诊断技术。应用的诊断技术。发展简史发展简史原位杂交的基本原理原位杂交的基本原理以以DNA分子复制原理为基础。分子复制原理为基础。两两条条核核苷苷酸酸单单链链片片段段，在在适适宜宜的的条条件件下下，通通过过氢氢键键结结合合，形形成成DNA-DNA、DNA-RNA或或 RNA-RNA 双双键键分分子子，应应用用带带有有标标记记的的（放放射射性性同同位位素素，如如3H、35S、32P，荧荧光光素素生生物物素素、地地高高辛辛等等非非放放射射性性物物质质）DNA或或RNA片片段段作作为为核核酸酸探探针针，与与组组织织切切片片或或细细胞胞内内待

18、待测测核核酸酸（RNA或或DNA）片片段段进进行行杂杂交交，然然后后可可用用放放射射自自显显影影等等方方法法予予以以显显示示，在在光光镜镜或或电电镜镜下下观观察察目的目的 mRNA或或DNA 的存在并定位；的存在并定位；应应用用原原位位杂杂交交技技术术，可可在在原原位位研研究究细细胞胞合合成成某某种种多多肽肽或或蛋蛋白白质质的基因表达。的基因表达。此此方方法法有有很很高高的的敏敏感感性性和和特特异异性性，可可进进一一步步从从分分子子水水平平来来探探讨细胞的功能表达及其调节机制。讨细胞的功能表达及其调节机制。在在细细胞胞或或组组织织结结构构保保持持不不变变的的条条件件下下，用用标标记记的的已已知

19、知的的RNA核核苷苷酸酸片片段段，按按核核酸酸杂杂交交中中碱碱基基配配对对原原则则，与与待待测测细细胞胞或或组组织织中中相相应应的的基基因因片片段段相相结结合合（杂杂交交），所所形形成成杂杂交交体体(Hybrids）经经显显色色反反应应后后在在光光学学显显微微镜镜或或电电子子显显微镜下观察其细胞内相应的微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和和tRNA分子。分子。RNA原原位位杂杂交交技技术术 经经不不断断改改进进，其其应应用用的的领领域域已已远远超超出出DNA原位杂交技术。原位杂交技术。尤尤其其在在基基因因分分析析和和诊诊断断方方面面能能作作定定性性、定定位位和和定定量量分分析析，已已

20、成成为为最最有有效效的的分分子子病病理理学学技技术术，同同时时在在分分析析低低丰丰度度和和罕罕见见的的mRNA表表达达方方面面已已展展示示了了分分子子生生物物学学的的一一重重要要方方向。向。原位杂交的基本原理原位杂交的基本原理原理：碱基互补配对原则原理：碱基互补配对原则定义定义：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNADNA双链解开双链解开 成两条单链的过程。成两条单链的过程。方法：方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：变性后其它理化性质变化：OD2

21、60OD260增高增高粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降浮力密度升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失DNA变性变性(denaturation)DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂DNADNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNADNA变性时其溶液变性时其溶液OD260OD260增高的现象。增高的现象。变性引起紫外吸收值的改变变性引起紫外吸收值的改变解解链链曲曲线线：如如果果在在连连续续加加热热DNADNA的的过过程程中中以以温温度对度对A260A260值作图，所得的曲线称为解链曲线值作图，所得的曲线称为解

22、链曲线。热变性热变性Tm：变变性性是是在在一一个个相相当当窄窄的的温温度度范范围围内内完完成成，在在这这一一范范围围内内，双双链链DNADNA变变性性一一半半所所需需要要的的温温度度称称为为DNADNA的的解解链链温温度度，又又称称熔熔解解温度温度,Tm)。其大小与其大小与G+C含量成正比。含量成正比。熔解温度熔解温度(melting temperature,Tm)Tm=（G+C）%0.41+69.3DNA复性复性在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNA的两条互补链的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后

23、即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing)。减色效应减色效应:DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低。降低。DNA复性复性复性复性RNADNA核酸核酸的变性、复性和杂交的变性、复性和杂交变性变性（加热）（加热）探针探针杂交杂交（缓慢冷却）（缓慢冷却）复性复性（缓慢冷却）（缓慢冷却）复复性性：在在一一定定条条件件下下，变变性性DNA DNA 单单链链间间碱碱基基重重新新配配对对恢恢复复双双螺螺旋旋结结构构，伴伴有有A A260260减减小小（减减色色效效应应）,DNA的功能恢复的功能恢复。1.1.核酸分子的浓度：一般适宜的探针浓度为核酸分子的

24、浓度：一般适宜的探针浓度为0.10.10.5g0.5g 2.2.核酸分子的长度：核酸探针的长度控制在核酸分子的长度：核酸探针的长度控制在5050300bp300bp 3.3.温度：适宜的复性温度是较温度：适宜的复性温度是较TmTm值低值低2525。4.4.离子强度：离子强度过低，不利于复性。离子强度：离子强度过低，不利于复性。5.5.核酸分子的复杂性。核酸分子的复杂性。影响复性速度的诸多因素影响复性速度的诸多因素(1)使用的探针不同：RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针，避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA杂交体比DNA-

25、DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳定，在杂交反应后可用RNA酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。(2)检测的目的不同：RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。其次为对外源性基因检测，以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而DNA原位杂交主要为外源性基因检测。(3)有较高的灵敏度：在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，RNA原位杂交能获得较好定位。RNA原位杂交特点原位杂交特点RNA原位杂交也存在某些不足之处，为使RNA原位杂交标准化和克服其不足之

26、处必须注意以下几点：(1)探针种类选择、制备和标记要适合靶核酸和组织的特点；(2)有效制止组织和细胞内RNA降解；实验流程严防RNA酶污染(3)杂交信号有效的放大和显色技巧；(4)阳性结果判别,不仅需要有阳性和阴性标本对照，有条件需要观测Northern杂交和免疫组化对同一组织的冰冻切片和石蜡切片中，基因及其产物两者表达之间联系。近几年来RNA原位杂交技术进展：非同位素标记的探针制备和标记技术的进步、杂交信号放大的应用、组织预处理的改进、RNA原位杂交和免疫组化双重检测技术和激光共聚焦显微镜在多重RNA原位杂交中应用等。RNA原位杂交不足之处原位杂交不足之处探针探针(probe)一一小小段段用

27、用同同位位素素、生生物物素素或或荧荧光光染染料料等等标标记记其其末末端端或或全全链链的的已已知知序序列列的的多多聚聚核核苷苷酸酸，与与固固定定在在NC膜膜上上的的核核苷苷酸酸结结合合，判判断断是是否否有有同同源的核酸分子存在。源的核酸分子存在。核酸探针的长度控制在核酸探针的长度控制在50300bp基因组基因组DNA探针探针 cDNA探针探针 RNA探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针核酸探针的种类（来源）核酸探针的种类（来源）RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。1.单单链链cDNA探探针针：由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又

28、克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。2.cRNA探探针针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNARNA杂交体稳定，不受RNA酶的影响。杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。cRNA探针的杂交饱和水平比双链DNA探针高出8倍，应用广泛。cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，它对RNA酶敏感，易受破坏。RNA探针探针RNA探

29、针探针3.寡寡核核苷苷酸酸探探针针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺缺点点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与mRNA形成的杂交体不如cRNARNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。1.1.高度灵敏性；高度灵敏性；2.2.高度特异性；高度特异性；3.3.标标记记物物与与探探针针结结合合，应应绝绝对对不不能能影影响响探探针针与与模模板板的的结结合

30、合能能力及结合的特异性；力及结合的特异性；4.4.当当用用酶酶促促方方法法进进行行标标记记时时，应应对对酶酶促促活活性性（KmKm值值）无无多多大大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；5.5.较高化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；较高化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；6.6.对环境无污染，对人体无损伤；对环境无污染，对人体无损伤；7.7.价格低廉等。价格低廉等。探针制备技术探针制备技术-探针的标记物探针的标记物放射性同位素：放射性同位素：3H、32P、35S、125I等。等。非放射性同位素：非放射性同位素：生物素生物素

31、 荧光、荧光、地高辛素、地高辛素、辣根过氧化酶、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。碱性磷酸酶等。不不同同的的同同位位素素探探针针其其穿穿透透力力，定定位位和和半半衰衰期期各各不不相相同同，无无一一种种同同位位素素探探针针具具有有穿穿透透力力强强、定定位位好好和和半半衰衰期期长长所所有有优优点点。由由于于半半衰衰斯斯短短，性性能能不不稳稳定定，污污染染环环境境和和危危害害健健康康等等，在在RNA原原位位杂杂交交中中应应用用同同位位素素标标记记探探针针已已日日趋趋减减少。少。地地高高辛辛标标记记的的cDNA、RNA和和寡寡核核苷苷酸酸探探针针，不不但但探探针针的的具具有有生生物物素素标标记记优优点点，还

32、还克克服服了了生生物物素素标标记记的的探探针针在在原原位位杂杂交交过过程程中中受受组组织织内内源源性性生生物物素素干忧等缺点，其应用越来越广泛。干忧等缺点，其应用越来越广泛。标记物的检测灵敏度排序：标记物的检测灵敏度排序：标记物的检测灵敏度排序：标记物的检测灵敏度排序：32323232P P P P35353535S S S S3 3 3 3H H H H地高辛地高辛地高辛地高辛/生物素生物素生物素生物素探针制备技术探针制备技术-常用探针标记常用探针标记物物常用的同位素有：常用的同位素有：35S、33P、32P 和和 3H标记分子：标记分子：35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP

33、32P-UTP 32P-dATP 等等等等放射性标记物放射性标记物探针制备技术探针制备技术-3232P P：释放：释放-粒子粒子,能量高能量高,穿透力极强穿透力极强3535S S：放射性亦较强，但：放射性亦较强，但-粒子能量较低，粒子能量较低，因此其检测灵敏度较因此其检测灵敏度较3232P P稍低。稍低。3 3H H：适用于细胞原位杂交。适用于细胞原位杂交。125125I I和和131131I I：碘放射性同位素在：碘放射性同位素在7070年代曾被年代曾被 广泛应用于核酸探针的标记。广泛应用于核酸探针的标记。放射性核素标记物（灵敏度极高）放射性核素标记物（灵敏度极高）非放射性标记物非放射性标记

34、物 被导入某个单核苷酸而形成标记分子被导入某个单核苷酸而形成标记分子 如：如：如：如：四甲基罗达明四甲基罗达明四甲基罗达明四甲基罗达明-UTP-UTP 生物素生物素生物素生物素-UTP (Bio-UTP)-UTP (Bio-UTP)地高辛地高辛地高辛地高辛-dUTPdUTP (Dig-(Dig-dUTPdUTP)溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子探针制备技术探针制备技术-无放射性污染，稳定性好无放射性污染，稳定性好半抗原：生物素、地高辛半抗原：生物素、地高辛配配 体：生物素体：生物素荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明化学发光物质化学发光物质:可以像放

35、射性核素一样直接对可以像放射性核素一样直接对X光光胶片进行曝光。胶片进行曝光。光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于细胞原位杂交，可以在光镜或电镜下进行观察。细胞原位杂交，可以在光镜或电镜下进行观察。非放射性标记物非放射性标记物在RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法：酶反应法和化学反应法。主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5端或3端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。酶反应法酶反应法探针标记方法探针标记方法

36、探针制备技术探针制备技术-体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链RNA探针的方法。体外转录时，先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板，以含有标标记记的的三三磷磷酸酸苷苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子，如大肠杆菌噬菌体T3、T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。SP6噬菌体的RNA聚合酶对SP6启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA聚合酶存在的条件下，即转录

37、成RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖核苷，所有的RNA就被标记。体外转录法体外转录法探针标记方法探针标记方法探针制备技术探针制备技术-非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。直直接接标标记记法法：即即化化学学反反应应法法，是是将将标标记记物物直直接接结结合合到到探探针针上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失，又不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素制抑，只能限于靶RNA丰富的细胞或组织中，RNA杂交对低拷贝的基因检测不理想。间间接接标标记记法

38、法：将将标标记记物物结结合合在在探探针针上上，通通过过特特异异性性抗抗体体识识别，由特异性抗体结合多种酶，对检测的杂交信号作放大。别，由特异性抗体结合多种酶，对检测的杂交信号作放大。这一类标记法已展示极好的发展前景。探针标记方法探针标记方法探针制备技术探针制备技术-酶促酶促标记法标记法（一）切口平移法（一）切口平移法（nick translation)1、利用、利用DNase I在在DNA双链上造成单双链上造成单链切口链切口2、利用大肠杆菌、利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的53 核酸外切酶活性在切口处将核酸外切酶活性在切口处将旧链从旧链从5 末端逐步切除末端逐步切除3、在、在DNA聚合酶聚

39、合酶I的的53 聚合酶聚合酶催化下，以互补的催化下，以互补的DNA单链为模板依单链为模板依次将次将dNTP连接到切口的连接到切口的3 末端末端-OH上，合成新的上，合成新的DNA链，同时将标记的链，同时将标记的核苷酸掺入到新的核苷酸掺入到新的DNA链中链中Mg2+离子离子只能标记双链只能标记双链DNA，使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不太小片段不太小（二）随机引物法二）随机引物法 其其原原理理是是随随机机引引物物能能与与各各种种单单链链DNA模模板板结结合合，作作为为合合成成新新链链的的引引物物，在在DNA聚聚合合酶酶的的催催化化下下，

40、按按53 方方向向合合成成一一新新的的DNA链链，其其核核苷苷酸酸序序列列与与模模板板DNA完完全全互互补补。另另一一单单链链DNA模模板板同同样样合合成成一一条条新新的的完完全全互互补补的的DNA链链。合合成成时时，带带放放射射性性核核素素标标记记的的核核苷苷酸酸掺掺入入到到新新合合成成的的DNA分子中分子中一般对基因组一般对基因组DNA进行标记时用这种方法的效果较好进行标记时用这种方法的效果较好随机引物法所具有的优点：随机引物法所具有的优点：1、能进行双链、能进行双链DNA、单链单链DNA或或RNA探针的标记探针的标记2、操作简单方便，避免因、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不

41、处理浓度掌握不当所带来的一系列问题当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以以上上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记（三）三）PCR标记法：标记法：将标记的核苷酸作为将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记反应的底物，以待标记的的DNA为模板，经为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入反应，标记的核苷酸掺入到新合成的到新合成的DNA分子中。分子中。某某些些标标记记探探针针必必须须经经纯纯化化后后方方可可使使用用。因因为为在在探探针针标标记记过过程程中中，反反应应液液中中仍仍存存在在一一些些未未被被

42、结结合合到到探探针针中中去去的的剩剩余余dNTP等等小小分分子。子。为为将将掺掺入入并并结结合合到到cDNA、cRNA和和标标记记寡寡核核苷苷酸酸与与游游离离标标记记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化氯仿抽提法进行纯化乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。因为酚虽能有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15%的水，从而溶解一

43、部分ploy(A)RNA。为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于RNA提取，显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。探针的纯化探针的纯化探针制备技术探针制备技术-1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除片段，可去除dNTP和和蛋白质蛋白质2、凝凝胶胶过过滤滤柱柱层层析析法法：利利用用凝凝胶胶的的分分子子筛筛作作用用，将将大大分分子子DNA和和小小分分子子dNTP、磷磷酸酸根根离离子子及及寡寡核核苷苷酸酸（80bp)等等物物质质分离，常用凝胶基质是分离，常用凝胶基质是Sephadex G-503、微微柱柱离离心心法法：其其原原

44、理理与与上上述述凝凝胶胶过过滤滤柱柱层层析析法法相相同同，不不同同的的是是上上述述采采用用洗洗脱脱的的方方式式纯纯化化探探针针，而而此此法法则则是是利利用用离离心心的的方方式来纯化探针式来纯化探针探针的纯化探针的纯化探针制备技术探针制备技术-靶核酸分子靶核酸分子 靶分子（或靶序列）：靶分子（或靶序列）：靶分子（或靶序列）：靶分子（或靶序列）：指所要探测的核酸分子或核苷酸序列指所要探测的核酸分子或核苷酸序列指所要探测的核酸分子或核苷酸序列指所要探测的核酸分子或核苷酸序列 （DNA DNA 或或或或RNARNA）DNA DNA 可以是中期染色体上的或是间期细可以是中期染色体上的或是间期细可以是中期

45、染色体上的或是间期细可以是中期染色体上的或是间期细 胞核内的，也可以是线粒体胞核内的，也可以是线粒体胞核内的，也可以是线粒体胞核内的，也可以是线粒体DNADNA或或或或 病毒病毒病毒病毒DNADNA RNA RNA 可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子 的的的的mRNAmRNA，也可以是核糖体也可以是核糖体也可以是核糖体也可以是核糖体rRNArRNA 线粒体或病毒线粒体或病毒线粒体或病毒线粒体或病毒RNARNA 放射性同位素标记探针放射性同位素标记探针放射自显影放射自显影非放射性同位素标记探针非

46、放射性同位素标记探针偶联反应偶联反应+显色反应显色反应核酸分子杂交信号的检测核酸分子杂交信号的检测Vermot J.2000.Endocrinology.Diao HL.2007.Fertil&SterilXie HR et al.2007.PANS35S35S地高辛地高辛地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法地高辛（Digoxigenin简写Dig-）又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应；地 高 辛 配 基 标 记 于 脱 氧 尿 嘧 啶 三 磷 酸 核 苷（dUTP）上形成Dig-11-dUTP。通过随即引物或缺

47、口平移法（多用随机引物法），将Dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成Dig-配基标记的核酸探针。采采用用人人工工方方法法可可将将地地高高辛辛的的线线型型间间隔隔臂臂与与dUTP连连接接起起一一来来形形成成DIG-11-dUTP，通通过过体体外外转转录录将将DIG-11-dUTP掺掺入入到到RNA探探针针中中，寡寡核核苷苷酸酸探探针针的的标标记记则则是是利利用用末末端端转转移移酶酶催催化化，在在单单链链3-羟羟基基端端直直接接添添加加DIG-11-dUTP尾尾巴巴，从从而而使使地地高高辛辛掺掺入入到到序序列列末末端端,达到标记的目的。达到标记的目的。地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法

48、将将这这种种标标记记的的探探针针与与组组织织、细细胞胞或或染染色色体体原原位位核核酸酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交；分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交；用用偶偶联联有有酶酶或或荧荧光光素素的的羊羊抗抗地地高高辛辛抗抗体体Fab（抗抗原原结合片断）结合物作为酶标或荧光标记；结合片断）结合物作为酶标或荧光标记；用用显显色色底底物物使使杂杂交交部部位位显显色色或或产产生生荧荧光光以以达达到到检检测测目的。目的。地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法近近年年来来，地地高高辛辛（Digoxigonin）标标记记技技术术引引起起科科技技工工作作者者的极大兴趣。的极大兴趣。1987年，地高辛标记

49、的有关试剂及药盒投放市场。年，地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。地地高高辛辛标标记记法法显显示示的的颜颜色色为为紫紫蓝蓝色色（标标记记碱碱性性磷磷酸酸酶酶-抗抗碱碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。地地高高辛辛较较放放射射性性标标记记系系统统安安全全，方方便便、省省时时间间。同同时时在在敏敏感感性性和和质质量量控控制制方方面面比比生生物物素素标标记记技技术术要要优优越越，可可以以检检测测出出人人基因组基因组DNA中的单拷贝基因。中的单拷贝基因。地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法CCCCC C取材、切片取材、切片杂杂交交流流程程观察、照相观察、照相地

50、高辛标记探针的显色检测常用免疫酶学显色检测方法有两类：Dig-HRP检测系统，检测系统，以以DAB/H2O2为底物，结果为棕色；为底物，结果为棕色；以以4-氯氯-1-萘酚萘酚/H2O2为底物，结果为为底物，结果为蓝色蓝色。Dig-AKP检测体系，检测体系，以以BCIP/NBT为底物，结果为为底物，结果为蓝紫色蓝紫色沉淀。沉淀。与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右，但HRP的优点为廉价、稳定。差异表达基因验证在围植入期子宫中的定位在围植入期子宫中的定位 原位杂交Bar:80m化学发光检测能