霍乱弧菌.ppt

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1、霍乱弧菌小组成员：陈海通林俊然罗泳健何坤尧冯远勤叶爱群傅健汶关于霍乱弧菌霍乱弧菌(Vibriocholerae)是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。共分为139个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱1。霍乱弧菌是人类霍乱的病原体,霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属于国际检疫传染病。特征新从病人分离出古典型霍乱弧菌和ELtor弧菌比较典型，为革兰氏阴性菌，菌体弯曲呈弧状或逗点状，菌体一端有单根鞭毛和菌毛，无荚膜与芽胞。经人工培养后，易失去弧形而呈杆状。取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观

2、察，可见细菌运动极为活泼，呈流星穿梭运动。在液体培养基内常呈单个、成对成链状，有的相连呈S形，甚至螺旋状1。营养要求不高，在霍乱弧菌PH8.89.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。因其他细菌在这一PH不易生长，故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形，光滑，透明。霍乱弧菌能还原硝酸银为亚硝酸盐，靛基质反应阳性，当培养在硝酸盐及色氨酸的培养基中，产生靛基质与亚硝酸盐，在浓硫酸存在时，生成红色，称为霍乱红反应，但其他非致病性弧菌亦有此反应，故不能凭此鉴定霍乱弧菌。ELTor型霍乱弧菌与古典型霍乱弧菌生化反应有所不同。前者Vp阳性而后者为阴性。前者能产生强烈

3、的溶血素，溶解羊红细胞，在血平板上生长的菌落周围出现明显的透明溶血环，古典型霍乱弧菌则不溶解羊红细胞。个别ELTor型霍乱弧菌株亦不溶血。致病人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食物经口传染。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，可能藉菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血流，仅在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌，从而患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌，此为本病典型的特征。霍乱肠毒素本质是蛋白质，不耐

4、热，56经30分钟，即可破坏其活性。对蛋白酶敏感而对胰蛋白酶抵抗。该毒素属外毒素，具有很强的抗原性。现已能将该毒素高度精制成晶状，仍保持极强的生物学活性。霍乱肠毒素的作用机制霍乱肠毒素致病机理如下：毒素由A和B两个亚单位组成，A亚单位又分为A1和A2两个肽链，两者依靠二硫链连接。A亚单位为毒性单位，其中A1肽链具有酶活性，A2肽链与B亚单位结合参与受体介导的内吞作用中的转位作用。B亚单位为结合单位，能特异地识别肠上皮细胞上的受体。1个毒素分子由一个A亚单位和46个B亚单位组成多聚体。霍乱肠毒素作用于肠细胞膜表面上的受体（由神经节苷脂GM1组成），其B亚单位与受体结合，使毒素分子变构，A精致单位

5、进入细胞，A1肽链活化，进而激活腺苷环化酶（AC），使三磷酸腺苷（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP），细胞内 cAMP浓度增高，导致肠粘膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻，由于大量脱水和失盐，可发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡。检测方法参照行业标准SNT1022-2010（1）第一次选择性増菌：以无菌操作称取25g样品，放入装有225ml灭菌APW増菌液的均质杯内，于8000r/min-10000r/min静置1min-2min,或以剪刀充分剪碎，制成1：10样品均液，深冻样品、干品、盐渍产品的初始増菌夜放置在37 1 培养61h，新鲜样品的初始増菌

6、放置在41.5 1培养61h。如果样品不够25g，则取全部样品，加入9xml増菌液以获得10-1浓度的样品均液如果上述制备的待验样品不能够在当日进行培养，应放置在2-8保存至次日注：加入样品前，APW应遇见保温至371摄氏度（2）第二次选择性増菌：从步骤1中去1ml培养物接种到10ml的APW中，至于41.51摄氏度培养181h（3）分离：分别用直径为3mm的接种环从步骤1和步骤2的APW増菌液中蘸取一接种环，划线接种TCBS琼脂和CHROMIDIBRIO弧菌显色培养基平板以分离菌落。在371 培养箱中将平板倒置培养。经过24h3h培养后，检查平板有无可疑菌落。在平板的背面标记可疑菌落。霍乱弧

7、菌在TCBS上的可以菌落形态为：表面光滑，黄色，直径约为2mm-3mm，霍乱弧菌在CHROMIDIBRIO弧菌显色培养基上的可疑菌落形态为：蓝色，蓝绿色到绿色菌落（某些弧菌如创伤弧菌及梅氏弧菌可能会产生与霍乱弧菌相似的蓝色到蓝绿色菌落）鉴定：（1）选择可疑菌落并纯化菌落：至少应挑取5个可疑菌落，进行传代培养。如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取传代培养。在氯化钠营养琼脂平板或试管斜面接种单个可疑菌落进行传代培养以获得纯培养物。在37 1 培养箱中培养24h3h，对氯化钠营养琼脂上的纯培养物进行鉴定。初步鉴定：显微镜下检测：1、革兰氏染色试验，霍乱弧菌为革兰氏染色阴性，无芽孢，弧形或弯曲

8、状；2、动力试验：将可疑菌落接种在一管APW，在37 1 培养1h-6h。滴一滴菌悬液于一干净的载玻片上，盖上盖玻片，镜下检查细菌运动性，霍乱弧菌培养物应为运动性阳性。氧化酶试验：以无菌白色滤纸蘸取营养琼脂表面纯培养物，滴加氧化酶试剂进行氧化酶试验。如果滤纸颜色在10s内变为紫色或者深紫色，则为阳性反应。氯化钠三糖铁试验：接种氯化钠三铁糖斜面，穿刺底层并划线斜面。37 1 培养箱中培养24h13h。反应结果：琼脂底层：黄色：葡萄糖发酵反应阳性 红色或未变色：葡萄糖发酵反应阴性（不发酵葡萄糖）黑色：产生硫化氢 产生气泡或培养基爆裂：葡萄糖发酵产气琼脂斜面：、黄色：乳糖或蔗糖阳性（利用乳糖或蔗糖）红色或未变色：乳糖或蔗糖阴性（不利用乳糖或蔗糖）可疑的霍乱弧菌在氯化钠三铁糖斜面上的反应为底层黄色，斜面黄色，不产生硫化氢，不产气。培养应不超过24h（斜面的黄色可能在24h后变为红色）谢谢谢谢