实验四+PCR及电泳技术.ppt

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1、实验实验4 PCR及及电泳技术电泳技术1.PCR1.PCR的基本原理的基本原理PCR基本原理基本原理 类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR的基本步聚的基本步聚 1、变性(Denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。2、退火(Annealing)：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。3、延伸(Extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸

2、反应。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR Cycle-Step 1-Denaturation Template DNA by Heat(95)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意图原理示意图 模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经加热至经加热至93左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；以便它与引物结合，为下轮反应作准备；5335ATCGCGAT

3、AGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5335ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加热加热94引物酶 模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DNA经加热变性成单链后，经加热变性成单链后，温度降至温度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；PCR Cycle-Step 2 Temperature is lowered(Tm)and primers anneal to target sequenc

4、esTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533引物酶3535TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3553PCR Cycle-Step 3-At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNA

5、Polymerase 引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物结合物在引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，以下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板制原理，合成一条新的与模板DNA 链。链。3535TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5533引物引物End of the 1st P

6、CR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence 每完成一个循环需每完成一个循环需2-4 min，2-3 h就能将待扩目的基因扩增放大就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。几百万倍。3535TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5533Target AmplificationNo.ofNo.Amplicon Cy

7、clesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 AmpliconPCR仪PCR仪PCR仪1、PCR反应成分1 1）模板）模板 单、双链单、双链DNADNA或或RNARNA都可以作为都可以作为PCRPCR的样品。若起始材料是的样品。若起始材料是RNARNA，须先通过逆转录得到第一条

8、须先通过逆转录得到第一条cDNAcDNA。一般一般100ng DNA100ng DNA模板模板/100/100 l l。模板浓度过高会导致反应的非模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。特异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。PCR反应体系模板模板引物引物TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶4种种dNTP混合物混合物MgMg2+2+10缓冲液缓冲液2）引物 （1 1）浓度）浓度 0.1-0.5 0.1-0.5 MM 浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键；

9、特异性反应的关键；PCRPCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度；产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度；人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLCHPLC进行纯化。进行纯化。3 3 3 3）TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 一般一般一般一般0.5-2.5 U/500.5-2.5 U/500.5-2.5 U/500.5-2.5 U/50 l l l l；酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对

10、照,再根据结果决定最佳条件。4 4）dNTPdNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度;四种四种四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等浓度应相等浓度应相等;PCR常用的浓度为常用的浓度为50-200M，不能低于，不能低于10-15M。浓度过高浓度过高浓度过高浓度过高会抑制会抑制Taq 酶的活性，酶的活性，易产生错误碱基的易产生错误碱基的易产生错误碱基的易产生错误碱基的 掺入，浓度过低则降低反应产量掺入，浓度过低则降低反应产量掺入，浓度过低则降低反应产量掺入，浓度过

11、低则降低反应产量5）10PCR缓冲液缓冲液(Mg2+)：500 mM KCl，100 mM Tris-HCl(pH 8.4)，150 mM MgCl2，1 mg/ml明胶。明胶。PCR反反应应体系：体系：10PCR buffer 2.5l dNTP mix 各各0.5l 引物引物1 0.5 l 引物引物2 0.5 l DNA模板模板 2 l Taq 酶酶 0.5 l 加双蒸水至加双蒸水至总总体体积为积为25lPCR扩增程序扩增程序:94,300S 94,60S 55,60S 72,60S 72,7min 30 循环循环2.电泳技术电泳技术电泳槽电泳槽制胶板制胶板梳子梳子电源电源电泳仪电泳仪提提

12、供供稳稳定定的的电电压压或或电电流流电电极极缓缓冲冲液液和和凝凝胶胶的的容容器器形形成成点点样样孔孔制制备备垂垂直直或或水水平平凝凝胶胶电泳分离的原理电泳分离的原理 电泳电泳(electrophoresis)溶液中带电粒子(离子)在电场中移动的现象。1 1、电荷效应、电荷效应 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。2 2、分子筛效应、分子筛效应 不同的分离介质形成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反则慢。3、待分离生物大分子的性质待分离生物大分子的性质 一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。4、电场强度电场强度 电场强度（V/cm）是

13、每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。电泳技术的种类电泳技术的种类 按支持介质的不同可分为：按支持介质的不同可分为：纸电泳纸电泳(Paper electrophorisis)醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis)琼脂凝胶电泳琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis)(PAGE)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳对于双链对于双链D

14、NA，电泳迁移率的大小主要与，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关分子大小有关。1、熔化琼脂糖时，宜低火，防暴沸；2、倒胶时温度要低于60且速度要慢；3、拔梳子和点样要小心，以免破坏胶孔；4、电泳仪打开前应检查电压、电流旋纽是否处于零位置，工作电压一般为60-80V，400mA，电泳完毕应将电压、电流旋钮恢复到零位置；5、防止EB污染和紫外灯伤眼。注意事项：琼脂糖浓度（）琼脂糖浓度（）DNA有效分离范围（有效分离范围（Kb）0.53010.7120.81.0100.51.270.41.530.2不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围 M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CK M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CK