定量PCR方法及数据分析.ppt

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1、定量定量PCR原理、应原理、应用及数据分析用及数据分析ZJW原理：原理：vPCRPCR（多聚酶链式反应（多聚酶链式反应)：一种体外扩增特异：一种体外扩增特异DNADNA片段片段的技术。反应分为的技术。反应分为变性变性（denaturationdenaturation）、）、退火退火（annealingannealing）、）、延伸延伸（extensionextension）三步。）三步。vPCRPCR扩增理论方程：扩增理论方程：起点定量与终点定量：起点定量与终点定量：起点的起点的DNADNA量为量为“天然天然”的含量，更有意义；终的含量，更有意义；终点的点的DNADNA量为经过量为经过PCRP

2、CR过程过程 “加工加工”的量，存在的量，存在部分部分“失真失真”。（终点定量存在更大的误差）。（终点定量存在更大的误差）v定量定量PCRPCR：通过实时监测通过实时监测PCRPCR每一个循环扩增产物每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量或者定性的分析或者定性的分析v化学原理：化学原理：荧光染料嵌合法荧光染料嵌合法,探针法探针法SYBR Green ISYBR Green I（不饱和型），（不饱和型），Eva Green/LC GreenEva Green/LC Green（饱和（饱和型），与型），与dsDNAdsDNA小沟部位嵌

3、合，小沟部位嵌合，具有绿色激发波长。游离时不具有绿色激发波长。游离时不发光。发光。缺点：需用缺点：需用melting curvemelting curve检测检测产物特异性。产物特异性。探针法：探针法：可用于多重可用于多重PCRPCR及基因分型及基因分型 TaqMan TaqMan 探针：探针：检测积累荧光检测积累荧光 一种寡核苷酸探针一种寡核苷酸探针,探针两端各锚定一个基团，淬灭剂则探针两端各锚定一个基团，淬灭剂则在在3 3末端。末端。TaqmanTaqman探针识别并结合特定探针识别并结合特定的靶序列；的靶序列；探针完整时，报告基团探针完整时，报告基团R R发发出的荧光被淬灭基团出的荧光被

4、淬灭基团Q Q吸收；吸收；在进行延伸反应时在进行延伸反应时,Taq,Taq聚合聚合酶的酶的 5 5外切酶活性将探针外切酶活性将探针切断切断,使得荧光基团与淬灭使得荧光基团与淬灭剂分离剂分离,发射荧光。一分子发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。的荧光信号的产生。v基线：基线：扩增曲线中的水平部分扩增曲线中的水平部分v阈值（阈值（Threshold):Threshold):指扩增曲线的指数增长区域指扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检测界限。内适当位置上设定的荧光检测界限。vCtCt值：值：从基数到指数增长的拐点所对应的循环次从基数到指数增长

5、的拐点所对应的循环次数数定量定量PCRPCR数学原理数学原理定量定量PCRPCR技术的应用技术的应用v定性分析：病毒病原菌检测、生物品种鉴定、定性分析：病毒病原菌检测、生物品种鉴定、SNPSNP分析等、基因突变分析等分析等、基因突变分析等v绝对定量：基因拷贝数分析，病毒病原菌定量分绝对定量：基因拷贝数分析，病毒病原菌定量分析等析等v相对定量：相对定量：mRNAmRNA表达分析，表达分析，siRNAsiRNA表达分析等表达分析等定量定量PCRPCR实验流程实验流程目标基因的查找、比对目标基因的查找、比对引物、探针的设计与合成引物、探针的设计与合成反应体系和条件的优化反应体系和条件的优化数据分析数

6、据分析定量定量PCRPCR引物设计的要求：引物设计的要求：v Tm=55-65 Tm=55-65 v GC=30-80%GC=30-80%v PCR PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在大，一般在 80-300bp 80-300bp 之间都可。之间都可。v 引物的退火温度要高，一般要在引物的退火温度要高，一般要在 6060以上。以上。内参基因的选择：内参基因的选择：v内参：内参：用于去除不同样本在用于去除不同样本在RNARNA的产量、质量以及的产量、质量以及逆转录效率差异对目标基因表达的影响。逆转录效率差异对目标基因表达的影响。v稳定表达于不同

7、类型的组织和细胞中（如正常细稳定表达于不同类型的组织和细胞中（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量无显著差异；胞和癌细胞），而且其表达量无显著差异；v高度或中度表达，排除太高或太低表达；高度或中度表达，排除太高或太低表达；v表达水平与细胞周期、细胞是否活化无关，且不表达水平与细胞周期、细胞是否活化无关，且不受任何外源性和内源性因素的影响。受任何外源性和内源性因素的影响。常见几种内参基因的优缺点：常见几种内参基因的优缺点：vGAPDH：在不同癌组织（包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌）在不同癌组织（包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌）中表达升高，在不同个体间、妊娠期间以及细胞周期的不中表达升高，在不同个体间、妊娠

8、期间以及细胞周期的不同阶段，以及多种因素刺激下（包括低氧、胰岛素、地塞同阶段，以及多种因素刺激下（包括低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子等）表达存在差异；米松、丝裂原、表皮生长因子等）表达存在差异；v-actin：细胞恶性转化时表达水平增加；细胞恶性转化时表达水平增加；v18S rRNA:rRNA合成的调节独立于合成的调节独立于mRNA。rRNA不包括不包括Poly A尾，在以尾，在以Oligo dT作为引物的作为引物的cDNA合成中不能被合成中不能被转录。转录。rRNA高丰度表达，远高于目标基因，较其他内参高丰度表达，远高于目标基因，较其他内参基因稳定，且受基因稳定，且受RNA降解

9、的影响比较小。降解的影响比较小。v反应体系的配制反应体系的配制 （25ul25ul体系）体系）组分组分加量加量模板模板cDNAcDNA2uL2uL10uM10uM引物引物F/RF/R各各0.5uL0.5uL2x SYBR Green 2x SYBR Green mixmix12.5uL12.5uLddH2OddH2O9.5uL9.5uL熔解曲线熔解曲线绝对定量：绝对定量：从荧光强度到拷贝数从荧光强度到拷贝数相对定量的数据分析相对定量的数据分析(2(2-CtCt法法/comparative Ct method)/comparative Ct method)Livak,K.J et al.Anal

10、ysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)Method.目标基因表达量（处理组目标基因表达量（处理组/非处理非处理组）的差异组）的差异Livak,K.J et al.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)Method.Livak,K.J et al.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)Method.Livak,K.J et al.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)Method.