实验一质粒DNA的提取及检测.pptx

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1、质粒（plasmid）是染色体外小型（是染色体外小型（1-2001-200kbkb）的共价、闭合、的共价、闭合、环状的双链环状的双链DNADNA分子（分子（cccDNAcccDNA），），能自主复能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（质粒的复制：严紧型复制（1 1 n n个个）松弛型复制（松弛型复制（2020个以上）个以上）第1页/共31页常用的质粒载体是通过是通过

2、DNADNA重组技术构建而成的。重组技术构建而成的。pUC18,pUC19pUC18,pUC19第2页/共31页质粒提取的思路质粒提取的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNADNA要去除的物质：要去除的物质：蛋白蛋白基因组基因组DNADNA脂类及小分子杂质脂类及小分子杂质RNA RNA 第3页/共31页第一部分质粒第一部分质粒DNA的提的提取取第4页/共31页一目的了解提取质粒的原理。学习和掌握质粒提取的方法和技术。细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒DNA的分离质粒DNA的纯化第5页/共31页二原理碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与

3、线性染色质碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在拓扑学上的差异：在碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA（可省略）。第6页/共31页原理示意图 返回目录 返回原理第7页/共31页三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（一

4、）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含（二）材料：含pUC18pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、（或其他）质粒的大肠杆菌、（三）试剂：（三）试剂：LBLB培养基（液体、固体）培养基（液体、固体）溶液溶液I I溶液溶液IIII溶液溶液IIIIIITE(pH8.0)TE(pH8.0)第8页/共31页溶液 I50 mmol/L 葡萄糖/1mg/mL溶菌酶25 mmol/L TrisCl(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)在10 lbf/in2(6.895104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4。作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活第9页/共31页溶液 I

5、I0.2 mol/L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。第10页/共31页溶液 III5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸水所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS线性DNA沉淀，K可中和DNA第11页/共31页TE(pH8.0)10 mmol/L TrisCl(pH8.0)1 mmol/L EDTA(pH8.0)RNA酶（降解RNA）作用：稳定第12页/共31页特点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）测序、转染（细提）质粒提取试剂

6、盒常用方法：小量碱裂解法满足不同需要的试剂盒纯化原理：离子交换柱层析等小量制备质粒kit大量制备质粒kit去除内毒素制备质粒kit可用于大部分分生实验第13页/共31页四、实验步骤接含接含pUC18(pUC18(或或pET21a)pET21a)质粒的单菌落于质粒的单菌落于3 3ml LB Ampml LB Amp+液体培液体培养基中养基中37370 0C C，190rpm190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜取取 ml菌液入菌液入ml的离心管中的离心管中 60006000rpmrpm、离心离心2 2minmin，弃上清，收集菌体弃上清，收集菌体100100uLuL溶液溶液I I悬浮菌体（悬浮菌体

7、（充分振荡充分振荡），室温），室温1010minmin加入加入200200uLuL溶液溶液IIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置5 5minmin裂解菌体裂解菌体第14页/共31页加入150150uLuL溶液IIIIII（轻轻混匀），冰上静置1515minmin质粒DNADNA复性1200012000rpmrpm，离心1515minmin，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿（振荡混匀）1200012000rpmrpm，离心1515minmin，取上清记录体积到一新管第15页/共31页上清加2 2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min 30min1200012000

8、rpmrpm，离心1515minmin沉淀用75%75%乙醇1 1mLmL洗涤两次（轻弹混匀、离心）1200012000rpmrpm，离心1010minmin晾干沉淀沉淀用2020ul TEul TE溶解沉淀法第16页/共31页吸附管用BL 500ulBL 500ul平衡取上清加入吸附管5000rpm 5000rpm 离心5min5min加PWPW漂洗液500ul500ul，放置2min2min10000rpm 10000rpm 离心5min5min，晾干加3 30 0ul TEul TE，10000rpm 10000rpm 离心5min5min（收集到干净的EPEP管中）吸附法第17页/共3

9、1页第二部分琼脂糖凝胶电泳第二部分琼脂糖凝胶电泳第18页/共31页相关知识电泳：泳动速度决定于？电泳：泳动速度决定于？琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂（天然琼脂（AgarAgar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose Agarose，约占约占8080）及琼脂胶）及琼脂胶（AgaropectinAgaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产

10、生较强的电渗现象，加之电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。脂糖为电泳支持物进行平板电泳。第19页/共31页琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 第20页/共31页核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型不同构型DNADNA的移动速度依次为：共价闭环超的移动速度依次为：共价闭环超螺旋螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA）直线直线DNADNA（LDNALDNA，2 2条条链发生断裂

11、）开环的双链环状链发生断裂）开环的双链环状DNADNA（ocDNAocDNA，1 1条链发生断裂）条链发生断裂）。第21页/共31页影响迁移率的因素DNADNA分分子子的的大大小小、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的浓浓度度、DNADNA的的构构象象、所所加加电电压压（一一般般5 5V/cmV/cm）、电电场场方方向向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。第22页/共31页一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA的方法和技术。的方法和技术。第23页/共31页二、实验原理 DNADNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛

12、效应。在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在时，整个分子带正电核酸为两性分子，在时，整个分子带正电,pH8pH8左右时，左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。碱基几乎不解离，整个分子带负电。在碱性环境下，相同碱基数量的双链在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNADNA几乎具有等量几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的同的相对分子质量的DNADNA片段泳动速度不一样，可进行片段泳动速度不一样，可进行分离。分离。DNADNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成分子的迁移速度与相对分子质

13、量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子。分子。共价闭环超螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA）直线DNADNA（LDNALDNA，2 2条链发生断裂）开环的双链环状DNADNA（ocDNAocDNA，1 1条链发生断裂）。第24页/共31页质粒的粒的电泳泳质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋线性开环 质粒DNA的存在形式有3种:1、共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在 2、开环DNA:质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消

14、除张力,形成松弛的环状分子 3、线性DNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.开环超螺旋线性第25页/共31页三、仪器、材料与试剂（一）仪器：稳流稳压电泳仪（一）仪器：稳流稳压电泳仪（二）材料（二）材料DNADNA（三）试剂（三）试剂 1 155TBETBE储液储液(pH8.0)(pH8.0)使用时稀释使用时稀释 10 10倍，成倍，成1TBE1TBE。2 2凝胶加样缓冲液（凝胶加样缓冲液（loading buffer）3.3.1%1%琼脂糖琼脂糖 4.10 4.10mg/mlmg/ml溴化乙锭溶液（溴化乙锭溶液（EBEB），），44保存。用时稀释保存。用时稀释成成 5 5ug/mlug

15、/ml的的EBEB。第26页/共31页四操作步骤n琼脂糖（1%）凝胶电泳n称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入电泳缓冲液，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解；n溶液冷至60，加入 EB至终浓度为g/ml，混匀，注意戴手套操作；n将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为，迅速插上梳子，检查有无气泡；n待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳buffer，让液面高出胶面1mm；n在DNA样品（20ul）中加入6 loading buffer（4ul），混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压100V；n根据指示剂的位置，判断是否终止电泳;n在紫外灯

16、下凝胶成像仪上观察电泳结果。第27页/共31页五、实验结果与讨论根据观察结果，绘图。分析自提质粒的情况。第28页/共31页图图1的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的质粒分子没有分开；另一方面有些样品质粒分子没有分开；另一方面有些样品RNA去除得不好，去除得不好，在电泳结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的在电泳结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的技巧，上样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的技巧，上样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始电泳，这样走出的条带会较均匀。图底部再开始电泳，这样走出的条带会较均匀。图2的结果的结果较好。较好。第29页/共31页六注意事项 n为提高质粒产量，要注意下面两个步骤：加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒510次)，使蛋白质和核酸变性；加溶液III后pH要达到中性(轻柔振荡510次)，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。第30页/共31页感谢您的观看！第31页/共31页