新型PCR检测技术解析.pptx

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1、回顾上节课所学回顾上节课所学PCR五个要素模板：单链或双链DNA引物：16-30 bp合成的寡核苷酸DNA聚合酶：耐热的Taq底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)液态反应体系：其中Mg2+是DNA聚合酶的激活剂基本程序94 30s 变性50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）72 n(按1扩增1kb计算）延伸 25-35个循环第1页/共42页基本内容基本内容一、多重PCR二、荧光定量PCR的原理三、实时荧光定量PCR的原理四、实时荧光定量PCR与常规的PCR的差别五、实时荧光定量PCR的应用六、课堂小结七、作业第2页/共42页一、一、多重PCR

2、1、定义：它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。区别在多对引物需要设计。第3页/共42页2、多重PCR的步骤：多重PCR扩增区域的选择。多对引物的设计。反应条件的选择及反应体系的优化（引物浓度、模板浓度、dNTP及酶的浓度、Mg2+浓度、加入DMSO、甘油或者BSA、PCR循环参数的设定）。结果分析一、多重PCR第4页/共42页一、多重PCR第5页/共42页3、多重PCR的特点高效性 在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。系统性 多

3、重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。经济简便性 多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。一、多重PCR第6页/共42页4、多重PCR的应用（5个实例）例一 肝炎病毒的感染，在同一病人体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染。有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠.一、多重PCR第7页/共42页4、多重PCR的应用（5个实例）例二 肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同

4、存一病人并同时发病.一、多重PCR第8页/共42页4、多重PCR的应用（5个实例）例三 性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断.战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检.需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.一、多重PCR第9页/共42页4、多重PCR的应用（5个实例）例四 某些遗传病及癌基因的分型鉴定。遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，通过常规PCR很难检测出来。例五 植物种质鉴定、植物病毒的检测、分子育种、快速检测外源基因的整合状态。一、多重PCR第10页/共42页二、二、荧光定量PCR的原理的原理 荧光定

5、量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。第11页/共42页二、二、荧光定量PCR的原理的原理荧光定量PCRPCR最常用于基因表达产物的分析，即将转录生成的单链mRNAmRNA逆转录成双链的cDNAcDNA,以此cDNAcDNA为模板进行反应。（动画）第12页/共42页 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。1、荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告

6、基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。二、荧光定量PCR的原理第13页/共42页1、荧光探针 二、荧光定量PCR的原理第14页/共42页1、荧光探针 二、荧光定量PCR的原理第15页/共42页1、荧光探针 二、荧光定量PCR的原理第16页/共42页1、荧光探针 二、荧光定量PCR的原理第17

7、页/共42页1、荧光探针 二、荧光定量PCR的原理第18页/共42页 2、荧光染料 在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。二、荧光定量PCR的原理第19页/共42页2、荧光染料二、荧光定量PCR的原理第20页/共42页2、荧光染料二、荧光定量PCR的原理观看视频动画第21页/共42页荧光探针特异性高探针设计要求高合成费用高多重PCR检出荧光染料简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR二、荧光定量PCR的原理3 3、荧光探针和荧光染料的区

8、别第22页/共42页荧光探针SNP解析病毒、病原菌的检测荧光染料mRNA表达量分析二、荧光定量PCR的原理4 4、荧光探针和荧光染料的用途第23页/共42页三、实时荧光定量三、实时荧光定量PCR的原理的原理 1、Ct 值 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-Ct值。C代表Cycle，t代表threshold（临界值）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。第24页/共42页 2、Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数

9、，纵坐标代表Ct值。三、实时荧光定量PCR的原理 第25页/共42页三、实时荧光定量PCR的原理 Ct起始拷贝数或起始浓度起始拷贝数或起始浓度标准曲线标准曲线第26页/共42页三、三、实时荧光定量PCR原理3、数据测定 在实时荧光定量PCR的反应体系中，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值。再利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。第27页/共42页三、三、实时荧光定量PCR原理3、数据测定第28页/共42页三、三、实时荧光定量PCR原理3、数据测定Rn(荧光信号荧光信号)循环数循环数C

10、ycle Number第29页/共42页三、三、实时荧光定量PCR原理3、数据测定操作过程第30页/共42页四、实时荧光定量四、实时荧光定量PCR与常规与常规PCR的差的差别别2、分析对象的差别：1、原理的差别：动画视频第31页/共42页四、实时荧光定量四、实时荧光定量PCR与常规与常规PCR的差的差别别3、使用仪器及结果输出形式的差别：第32页/共42页五、五、实时荧光定量PCR的应用1.病原体检测 2.产前诊断 3.药物疗效考核 4.肿瘤基因检测 5.新药开发研究 6.超早期感染用药物及疗法的研究与开发 第33页/共42页1、病原体检测 目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣

11、原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。五、实时荧光定量PCR的应用第34页/共42页2、产前诊断 到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生。如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。五、实时荧光定量PCR的应用第35页/共42页3、药物疗效考核 比如，对乙型

12、肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感。五、实时荧光定量PCR的应用第36页/共42页 癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。五、五、实时荧光定量PCR的应用4、肿瘤基因检测 第37页/共42页5、新药开发研究 针对一些感染性疾病的药物，如各种病毒病、细菌病等，在新药的开发过程中

13、，快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金，与以前所用的常规方法相比，实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量，因此有利用分析药物的作用效果，为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。五、实时荧光定量PCR的应用第38页/共42页6、超早期感染用药物及疗法的研究与开发 实时荧光定量PCR方法测定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人体内产生抗体，同时，由于其灵敏度与Elisa相比不可同日而语，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低时就可以测定。因此就出现了一个新的领域，即在病毒或细菌含量很低时如何用药，用什么药以及用药量等进行研究，为将疾病消灭在超早期作出贡献。五、实时荧光定量PCR的应用第39页/共42页六、课堂小结七、作业：CT值？第40页/共42页O(_)O 谢谢！第41页/共42页感谢您的观看。第42页/共42页