细胞工程动物细胞融合与单克隆抗体.pptx
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1、第一节 动物细胞融合一、动物单个细胞的获得动物细胞虽然没有细胞壁,但细胞间的连接方式多样而复杂,在进行有效的细胞融合之前,也必需获得单个分散的细胞。第1页/共49页组织的获得 采用各种适宜的方法处死动物,取出组织块放入小烧杯中,用剪刀将组织块剪碎成1mm3大小,用吸管吸取Hanks溶液冲下剪刀上的碎块,补加35ml的Hanks溶液,用吸管轻轻吸打,低速离心,弃去上清液,留下组织块。第2页/共49页组织的消化 通过生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。根据不同的组织对象采用不同的酶消化液。如最常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。其他的酶如链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。
2、EDTA最适合消化传代细胞,常与胰蛋白酶使用。第3页/共49页胶原酶消化是一种由细菌中提取的酶,对胶原和细胞间质有较强的消化作用,适用于消化纤维组织、上皮组织、癌组织等。第4页/共49页(1)向培养瓶中放入15mm3大小的组织块,加5ml 2000单位/ml的胶原酶干液,最终浓度为200单位/ml,pH=6.5。(2)36.5水浴448小时,无需摇动,中间可更换酶液一次。(3)当组织变软,分散于瓶底时,轻轻震荡即散成细胞团或单个细胞,小心倒出培养液。(4)800r/min离 心 5分 钟,弃 上 清 液,重 新 悬 浮BSS溶液中,再离心一次。(5)加入培养液制成细胞悬浮液第5页/共49页二、
3、细胞融合的方法细胞融合的方法包括:PEG法融合电融合病毒介导融合第6页/共49页1 1 1 1PEGPEGPEGPEG诱导融合法诱导融合法 PEGPEGPEGPEG诱导融合的特点:诱导融合的特点:优点-成本低,勿需特殊设备;融合子产生的异核率较高;融合过程不受物种限制。缺点-过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害。PEGPEGPEGPEG的作用机理:的作用机理:PEG分子具有轻微的负极性,故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键,从而在原生质体之间形成分子桥,其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合;PEG能增加类脂膜的流动性,也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。第7页
4、/共49页操作步骤第8页/共49页融合液:CaCl22H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.51.0mol pH 5.6诱导液:融合液PEG 2045稀释液:A A液(g/100ml)pH6.0 葡萄糖 7.21 CaCl22H2O 0.79DMSO 10ml B B液(g/100ml)pH10.5 甘氨酸 0.375 NaOH 0.169第9页/共49页2 2电融合首先,通过双向电泳使细胞间的接触变得非常紧密(高频交流电)。在活细胞等微粒的内部,诱导去极化,引起细胞聚集,排列成串珠状,互相紧密接触。然后给予短暂的高压脉冲,引起细胞膜的穿透,随后细胞膜发生结
5、合导致细胞融合。为了稳定这个过程,在短期内需要施加交流电压。第10页/共49页电融合的优点与PEG融合比较起来,电融合有三大优点:1、不存在对细胞的毒害问题;2、融合效率高;3、融合技术操作简便第11页/共49页电融合的基本过程电融合的基本过程 细胞膜的接触:细胞膜的接触:当原生质体置于电导率很低的溶液中时,电场通电后,电流即通过原生质体而不是通过溶液,其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子,从而使原生质体紧密接触排列成串;膜的击穿:膜的击穿:原生质体成串排列后,立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿,从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。关于融合参数:关于融合参数:电融合中的主要参数
6、包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间;直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。第12页/共49页3.病毒介导的融合略第13页/共49页影响细胞融合的因素首先,细胞的质量对细胞融合起着至关重要的作用,高质量的细胞是细胞融合的首要条件。其次,融合方法其三,融合参数,包括各种融合液都应选择适当。第14页/共49页三、杂种细胞的筛选原理:两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞,筛选的目的是获得优良的杂种细胞。1)亲本 2)同核体:同源原生质体的融合体3)异核体:非同源的原生质体的融合体4)多核体:含有双亲不同比例核物质的融合体5)异胞质体:具有不同胞质来源的杂合细胞。6)核质体:有细
7、胞核而带有少量细胞质的亚原生质体第15页/共49页动物细胞的筛选方式:动物细胞的筛选方式:动物细胞的筛选方式:动物细胞的筛选方式:1)利用抗药性筛选系统:利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。亲本A:对氨苄青霉素敏感,对卡娜霉素不敏感亲本B:对卡娜霉素敏感,对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长第16页/共49页2)营养互补筛选系统:细胞在缺乏一种或几种营养成分时,不能生长繁殖,即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本A:色氨酸缺陷型亲本B:苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养,而亲本细胞均会死亡。第17页/共49
8、页3)温度敏感突变型杂种细胞的筛选:一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长,但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。亲本一:具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。亲本二:高温敏感突变型,但不能抗卡娜霉素。杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。第18页/共49页第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体第19页/共49页一、抗体的结构与功能一、抗体的结构与功能一、抗体的结构与功能一、抗体的结构与功能1 1 1 1、抗原:、抗原:、抗原:、抗原:进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。激作用的外源物质。包括:蛋白质、多糖、核
9、酸、病毒、细菌、各种包括:蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。细胞等。特点:外源性、结构性(分子表面具有稳定的环特点:外源性、结构性(分子表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点)、特异性(抗原与抗状结构基团作为识别位点)、特异性(抗原与抗体的反应)。体的反应)。第20页/共49页2 2抗体抗体动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的糖蛋白,存在于血清中,本质是免疫影响的糖蛋白,存在于血清中,本质是免疫球蛋白(球蛋白(Immuniglobulin,IgImmuniglobulin,Ig)。)。第21页/共49页第22页/共49页动物脾脏有上百万个
10、动物脾脏有上百万个B B淋巴细胞淋巴细胞,一个细胞就是一个克隆,它一个细胞就是一个克隆,它针针对抗原上的一个抗原决定簇产对抗原上的一个抗原决定簇产生的抗体是单克隆抗体生的抗体是单克隆抗体。一种抗原通常具有多个不同的一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇,因此能刺激多个抗原决定簇,因此能刺激多个B B淋巴细胞产生相应的单克隆抗淋巴细胞产生相应的单克隆抗体体,因此血清中的抗体是针对,因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体不同抗原决定族的单克隆抗体混合物,称为多克隆抗体。混合物,称为多克隆抗体。第23页/共49页人体内的五种抗体第24页/共49页二、单克隆抗体的制备二、单克隆抗体的制备动物免
11、疫与亲本细胞动物免疫与亲本细胞的选择的选择细胞融合:淋巴细胞细胞融合:淋巴细胞杂交瘤的制备杂交瘤的制备杂交瘤细胞的筛选:杂交瘤细胞的筛选:有限稀释法等有限稀释法等单克隆抗体的制备和单克隆抗体的制备和冻存冻存单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化第25页/共49页亲本细胞的选择亲本细胞的选择亲本细胞的选择亲本细胞的选择骨髓瘤细胞:一般不分泌抗体,能在体外无限繁殖和连续继代培养,且为HPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)或TK(胸腺嘧啶核苷激酶)。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。第26页/共49页淋巴细胞:经过免疫处理的淋巴细胞,多用大鼠或小鼠。免疫方法:体内法或体外法。体内法:对细胞或微生物抗原
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