noggin基因诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的相关研究周盛.pptx

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1、 关键词:1 骨髓基质干细胞2 Noggin 基因3 诱导第1页/共32页 立项依据在骨髓中存在两大类干细胞：造血干细胞 骨髓基质干细胞第2页/共32页1.造血干细胞造血干细胞可以增殖并分化为其他血液细胞，能够重建宿可以增殖并分化为其他血液细胞，能够重建宿主的血液系统主的血液系统.通过限制性分化过程，使其子代通过限制性分化过程，使其子代细胞逐渐成熟，产生红细胞、血小板、单核细细胞逐渐成熟，产生红细胞、血小板、单核细胞、粒细胞等成熟细胞，不断补充血液细胞胞、粒细胞等成熟细胞，不断补充血液细胞.一一般认为在人体内般认为在人体内CD34阳性细胞、鼠内为阳性细胞、鼠内为Sca1阳性细胞富含阳性细胞富含

2、HSC。第3页/共32页 骨髓基质干细胞（骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs)又称骨髓间充质干细胞又称骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）即是指骨髓基质系统中所含有的一类多能干细胞，即是指骨髓基质系统中所含有的一类多能干细胞，它不表达造血细胞的相关标志，具有向多种中胚层它不表达造血细胞的相关标志，具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力。第4页/共32页骨髓基质干细胞特性骨髓基质干细胞特性 1.具有具有自我更新的能力和多向分化潜能自我更新的能力和多向分化潜能，处在不同

3、的微，处在不同的微环境中能分化成多个细胞系环境中能分化成多个细胞系,形成多种间充质细胞形成多种间充质细胞,包括成骨包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等,特别是能够特别是能够横向横向分化分化为神经细胞和胶质细胞。为神经细胞和胶质细胞。第5页/共32页 2.BMSCs 具有具有易于获得、培养、增殖易于获得、培养、增殖,多次传代后多次传代后仍保持干细胞特性并能定向分化为所需细胞仍保持干细胞特性并能定向分化为所需细胞,移植后内能移植后内能长期存活长期存活,诱发的诱发的免疫反应较弱免疫反应较弱等特点等特点,并且可以促进胚胎并且可以促进胚胎干细胞和神经干细胞增殖

4、和分化干细胞和神经干细胞增殖和分化,在神经损伤修复、基因在神经损伤修复、基因治疗、造血重建等实验和临床研究中皆具有良好的应用治疗、造血重建等实验和临床研究中皆具有良好的应用前景。前景。骨髓基质干细胞特性第6页/共32页 3.BMSCs 在体外可以在体外可以大量扩增大量扩增、自体移植自体移植可以避免可以避免免疫排斥反应和具有强大的可塑性免疫排斥反应和具有强大的可塑性.4.可作为多种疾病细胞替代治疗和可作为多种疾病细胞替代治疗和基因治疗的载体基因治疗的载体,使使BMSCs 成为当今生命科学领域研究的热点之成为当今生命科学领域研究的热点之骨髓基质干细胞特性第7页/共32页Noggin Noggin基

5、因是基因是1992年年California大学的大学的Harland,R.M.和和 Smith,W.C.从非洲蟾蜍的胚胎中分离出来的。从非洲蟾蜍的胚胎中分离出来的。此后发现该基因在胚胎发育中有重要此后发现该基因在胚胎发育中有重要神经诱导作用神经诱导作用，尤其，尤其是诱导外胚层的背侧发育；亦表达于出生后及成年哺乳动是诱导外胚层的背侧发育；亦表达于出生后及成年哺乳动物中枢神经系统内，调控成年海马、室下区神经干细胞的物中枢神经系统内，调控成年海马、室下区神经干细胞的增殖和分化，在学习和记忆的形成过程中有重要的作用增殖和分化，在学习和记忆的形成过程中有重要的作用 第8页/共32页Noggin nogg

6、in基因是目前在体内与体外均被证实有基因是目前在体内与体外均被证实有神经诱导神经诱导作用的神经诱导剂。其神经诱导功能主作用的神经诱导剂。其神经诱导功能主要是通过拮抗要是通过拮抗骨形成蛋白骨形成蛋白（bone morphogenetic protein-4,BMP4）的作用实现）的作用实现的。的。BMP可促进胶质细胞的分化而抑制神经发生，可促进胶质细胞的分化而抑制神经发生，而而noggin蛋白则促进神经发生蛋白则促进神经发生 第9页/共32页诱导诱导 因骨髓基质干细胞有良好的可塑性，在外界诱导因子因骨髓基质干细胞有良好的可塑性，在外界诱导因子刺激下可分化为各类神经细胞。刺激下可分化为各类神经细胞

7、。目前一般有三种方法可以诱导分化目前一般有三种方法可以诱导分化BMSCs为神经细胞为神经细胞抗氧化剂、生长因子和转基因诱导。抗氧化剂、生长因子和转基因诱导。在转基因诱导法中我在转基因诱导法中我们引入了们引入了Noggin基因基因神经诱导基因。神经诱导基因。第10页/共32页课题思路课题思路 我们构建带有我们构建带有Noggin基因的载体，并将它转染到基因的载体，并将它转染到BMSCs中，预期它能够诱导中，预期它能够诱导BMSCs分化为神经细胞，分化为神经细胞，并对分化后的神经元样细胞进行检测。在细胞形态、分子、并对分化后的神经元样细胞进行检测。在细胞形态、分子、基因、电生理水平均可证实为神经细

8、胞基因、电生理水平均可证实为神经细胞第11页/共32页1.骨髓基质干细胞培养骨髓基质干细胞培养 用用Percoll淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓基质淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓基质干细胞，并用含干细胞，并用含20%胎牛血清的胎牛血清的DMEM/F12培养液培养液培养，胰酶消化传代，扩增大鼠骨髓基质细胞。显微培养，胰酶消化传代，扩增大鼠骨髓基质细胞。显微镜下观察形态镜下观察形态第12页/共32页BMSCs 细胞多为梭形、星形,核椭圆。细胞培养至集落间相互汇合时,传代培养,3代以后细胞均一性好,成漩涡状生长。第13页/共32页2.扩增带有扩增带有Noggin基因的表达载体基因的表达载体 将构建好的带

9、有目的基因将构建好的带有目的基因Noggin的质粒转化感受态的质粒转化感受态大肠杆菌株大肠杆菌株DH5，挑菌落提取质粒后进行重组体测序鉴，挑菌落提取质粒后进行重组体测序鉴定。经酶切、定。经酶切、PCR鉴定。鉴定。第14页/共32页3.将带有将带有Noggin基因的表达载体导入骨基因的表达载体导入骨髓基质细胞内诱导其为神经细胞髓基质细胞内诱导其为神经细胞 取第四代、第六代取第四代、第六代BMSC，用脂质体转染法介导，用脂质体转染法介导Noggin基因进入到骨髓基质细胞内。观察细胞形态的改基因进入到骨髓基质细胞内。观察细胞形态的改变。变。第15页/共32页形态学观察形态学观察第16页/共32页4.

10、检测与鉴定检测与鉴定1.利用免疫细胞化学技术鉴定分化细胞是否表达利用免疫细胞化学技术鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性标记神经细胞特异性标记;2.利用利用RT-PCR技术检测部分参与神经细胞生理技术检测部分参与神经细胞生理功能的基因功能的基因.3.利用膜片钳技术检测诱导后的神经细胞是否具利用膜片钳技术检测诱导后的神经细胞是否具有电生理功能。有电生理功能。第17页/共32页1).免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 转染后细胞NSE阳性（100）转染后细胞MAP-2阳性（100）第18页/共32页免疫荧光免疫荧光 转然后细胞 NSE染色 转然后细胞MAP-2染色 第19页/共32页2)RT-PCR空

11、白对照组 空质粒对照组 Noggin诱导组Marker自上而下依次是100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000;基因排列顺序及大小为NCAM-295,GFAP-792,-actin-314，SYN-1577,GAP-43-229,NOGGIN760第20页/共32页3)膜片钳技术膜片钳技术原理：膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础的，利用原理：膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，是一玻璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，是一种典型的低噪声测量技术，可以说达到当今电子测量的极种典型的低噪

12、声测量技术，可以说达到当今电子测量的极限限 第21页/共32页操作步骤操作步骤 1微电极的制备 拉制 电极优化处理 电极充灌2全细胞跨膜总电流的记录 施加正压 电极入水 高阻封接 破膜第22页/共32页第23页/共32页预期结果预期结果应用膜片钳技术对骨髓基质干细胞分化的神经元样细胞进应用膜片钳技术对骨髓基质干细胞分化的神经元样细胞进行了电生理特性检测。行了电生理特性检测。预期结果证实神经元样细胞具有活跃的电生理特性。且与预期结果证实神经元样细胞具有活跃的电生理特性。且与骨髓基质干细胞的电生理特性有明显差异。骨髓基质干细胞的电生理特性有明显差异。第24页/共32页BMSCNoggin神经元样细

13、胞免疫荧光RT-PCR膜片钳免疫组化第25页/共32页质疑和争论质疑和争论 骨髓基质细胞分化为神经细胞被认为是一骨髓基质细胞分化为神经细胞被认为是一种跨胚层发育，不少学者对细胞的这种跨胚层分种跨胚层发育，不少学者对细胞的这种跨胚层分化表示质疑，认为这是由于其他原因导致产生的化表示质疑，认为这是由于其他原因导致产生的一种假象。质疑与争论的焦点主要集中在以下三一种假象。质疑与争论的焦点主要集中在以下三个方面：个方面：诱导剂的细胞毒性作用诱导剂的细胞毒性作用细胞融合细胞融合骨髓组织内是否存在其他干细胞骨髓组织内是否存在其他干细胞第26页/共32页1诱导剂的细胞毒性作用诱导剂的细胞毒性作用 有学者认为

14、细胞的这种有学者认为细胞的这种“神经细胞样神经细胞样”变化（即折光变化（即折光性增强，胞体变圆，轴突形成），并不是干细胞分化为了性增强，胞体变圆，轴突形成），并不是干细胞分化为了神经细胞，而是细胞对外界毒性环境的一种保护性反应，神经细胞，而是细胞对外界毒性环境的一种保护性反应，是细胞发生了皱缩，是细胞骨架改变的结果是细胞发生了皱缩，是细胞骨架改变的结果第27页/共32页2 细胞融合细胞融合 在对移植过男性骨髓的女性白血病患者进行研究时，在对移植过男性骨髓的女性白血病患者进行研究时，发现宿主的少数神经细胞含有发现宿主的少数神经细胞含有Y染色体，说明这些细胞是染色体，说明这些细胞是供者骨髓来源的。

15、进一步研究发现，在这些细胞里面，部供者骨髓来源的。进一步研究发现，在这些细胞里面，部分细胞含有两个以上的性染色体，提示可能为细胞融合的分细胞含有两个以上的性染色体，提示可能为细胞融合的结果。对于发生融合的细胞来说，如果不进行染色体分析，结果。对于发生融合的细胞来说，如果不进行染色体分析，仅仅检测移植细胞表达神经细胞特异性标识物，那么就会仅仅检测移植细胞表达神经细胞特异性标识物，那么就会误认为移植细胞分化成了神经细胞，产生一种假象误认为移植细胞分化成了神经细胞，产生一种假象 第28页/共32页3.骨髓组织内是否存在其他干细胞骨髓组织内是否存在其他干细胞 骨髓基质细胞是一种异质体，包含有许多未知种

16、骨髓基质细胞是一种异质体，包含有许多未知种类的细胞，其中就有可能为多能干细胞和异位神经干细类的细胞，其中就有可能为多能干细胞和异位神经干细胞。即便是这些细胞的数量非常少，在试验的条件下也胞。即便是这些细胞的数量非常少，在试验的条件下也可以分化为神经细胞。这种干细胞的分化能力很强，在可以分化为神经细胞。这种干细胞的分化能力很强，在特定诱导条件下，可以分化为肌肉细胞、成骨细胞、软特定诱导条件下，可以分化为肌肉细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞及神经细胞等。另外也报道骨细胞、脂肪细胞、肝细胞及神经细胞等。另外也报道证实在成年动物的肠内发现有神经脊干细胞，这些细胞证实在成年动物的肠内发现有神经

17、脊干细胞，这些细胞可以分化为神经细胞。但目前尚缺乏证据证明骨髓内存可以分化为神经细胞。但目前尚缺乏证据证明骨髓内存在这样的神经干细胞在这样的神经干细胞第29页/共32页总结和展望总结和展望我们研究发现携带我们研究发现携带Noggin基因的骨髓基质细胞在体外可基因的骨髓基质细胞在体外可以分化为神经元样细胞。以分化为神经元样细胞。若这些细胞分布在脑卒中组织内，表达若这些细胞分布在脑卒中组织内，表达noggin蛋白，诱蛋白，诱导更多的导更多的BMSC分化为神经细胞，这样就可以提供足够多分化为神经细胞，这样就可以提供足够多的种子细胞，为研究卒中后神经通路的重建和神经功能的的种子细胞，为研究卒中后神经通路的重建和神经功能的最大恢复奠基了基础，开创了脑卒中的治疗提供了新的途最大恢复奠基了基础，开创了脑卒中的治疗提供了新的途径。径。因此，今后我们将进一步明确分化细胞的性质和开展这些因此，今后我们将进一步明确分化细胞的性质和开展这些细胞在治疗脑卒中的研究，探索治疗脑卒中的新途径细胞在治疗脑卒中的研究，探索治疗脑卒中的新途径第30页/共32页谢谢第31页/共32页感谢您的观看！第32页/共32页