蛋白质的结构与功能的关系 (2)精选PPT.ppt

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1、关于蛋白质的结构与功能的关系(2)第1页，讲稿共71张，创作于星期三一、蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系前体与活性蛋白质前体与活性蛋白质分子病分子病蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系肌红蛋白的结构与功能肌红蛋白的结构与功能血红蛋白的结构与功能血红蛋白的结构与功能第2页，讲稿共71张，创作于星期三(一一)蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系1.一级结构一级结构是空间构象的基础是空间构象的基础 在在生生物物体体内内，蛋蛋白白质质的的多多肽肽链链一一旦旦被被合合成成后后，即即可可根根 据据一一级级结

2、结构构 的的特特点点自自然然折折叠叠和和盘盘曲曲，形形成成一一定定的的空空间间构构象象，特特定定的的空空间间构构象象主主要要是是由由蛋蛋白白质质分分子子中中多多肽肽链链和和侧侧链链 R R基基团团形形成成的的次次级级键键来来维维持持的的。蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构决决定定了了它它的的二二级级、三三级级结结构构，即即由由一一级级结结构构可可以以自自动动地地发发展展到到二二、三三级级结结构构。、第3页，讲稿共71张，创作于星期三ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY一一 级级 结结 构构二级结构二级结构蛋白质的结构基础蛋白质的结构基础三三 级级 结结 构构四四 级级 结结 构构第4页，讲稿

3、共71张，创作于星期三一级结构是空间构象的基础一级结构是空间构象的基础 牛核糖核酸酶的结牛核糖核酸酶的结构构二二硫硫键键第5页，讲稿共71张，创作于星期三 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶核糖核酸酶核糖核酸酶A变性，酶的三级结构和变性，酶的三级结构和活性完全丧失，生成含有活性完全丧失，生成含有8个巯基的个巯基的多肽链。多肽链。加脲和巯加脲和巯基乙醇基乙醇去除脲和巯基乙醇，又去除脲和巯基乙醇，又恢复到天然状态恢复到天然状态核糖核酸酶核糖核酸酶A变性和复性变性

4、和复性第6页，讲稿共71张，创作于星期三 胰岛素（胰岛素（Insulin）首先合成）首先合成108个氨基酸的个氨基酸的前胰岛素原前胰岛素原（pre-proinsulin），），随即切去随即切去N-端的端的24个氨基酸信号肽，个氨基酸信号肽，形成形成84个氨基酸的个氨基酸的胰岛素原胰岛素原（proinsulin），），形成正确的二形成正确的二硫键，硫键，在包装分泌时，在包装分泌时，A、B链之间的链之间的33个氨基酸个氨基酸C肽肽残基被残基被切除，才形成切除，才形成胰岛素。胰岛素。人工合成的胰岛素，人工合成的胰岛素，A、B链分别合成后，链分别合成后，等比例混合后就有活性。等比例混合后就有活性。2.

5、前体前体与与活性蛋白质活性蛋白质一级结构的关系一级结构的关系第7页，讲稿共71张，创作于星期三胰岛素的体内合成胰岛素的体内合成胰岛素基因胰岛素基因mRNA核糖体核糖体SSSSSSB chainSSSSSSA chain胰岛素原胰岛素原 9kDa胰岛素胰岛素 5.5 5.5kDakDaC 肽肽GOLGI分泌颗粒分泌颗粒 血血 液液Zn2+MICROCRYSTALS切割位点切割位点A肽肽B肽肽30 aa33 aa21 aa前胰岛素原前胰岛素原 11.5 kDaRER600600核苷酸核苷酸C肽肽24 aa信号肽信号肽第8页，讲稿共71张，创作于星期三3.蛋白质一级结构的蛋白质一级结构的种属差异种属

6、差异与与分子进化分子进化对于对于不同种属来源不同种属来源的的同种蛋白质同种蛋白质进行一级结构测定和比较，发进行一级结构测定和比较，发现存在种属差异，这种差异可能是分子进化的结果，但现存在种属差异，这种差异可能是分子进化的结果，但与功能相与功能相关的结构总是有高度的保守性关的结构总是有高度的保守性。以细胞色素以细胞色素C C为例为例：细胞色素：细胞色素C C广泛存在于真核生物细胞的线粒体中，广泛存在于真核生物细胞的线粒体中，是一种含有血红素辅基的单链蛋白质。在生物氧化时，细胞色素是一种含有血红素辅基的单链蛋白质。在生物氧化时，细胞色素C C在呼吸在呼吸链的电子传递系统中起传递电子的作用，使血红素

7、上铁原子的价链的电子传递系统中起传递电子的作用，使血红素上铁原子的价数发生变化。数发生变化。第9页，讲稿共71张，创作于星期三细胞色素细胞色素c c的一级结构与生物进化的关系的一级结构与生物进化的关系第10页，讲稿共71张，创作于星期三n脊椎动物的细胞色素脊椎动物的细胞色素C C由由l04l04个氨基酸残基组成；昆虫有个氨基酸残基组成；昆虫有108108个氨基个氨基酸残基组成；植物则有酸残基组成；植物则有112112个氨基酸残基组成。个氨基酸残基组成。n对不同生物的细胞色素对不同生物的细胞色素C C的一级结构分析表明，大约有的一级结构分析表明，大约有2828个氨基酸残个氨基酸残基是各种生物共有

8、的，表明这些氨基酸残基是规定细胞色素基是各种生物共有的，表明这些氨基酸残基是规定细胞色素C C的生物功的生物功能所必需的。其中包括能所必需的。其中包括第第1414和和1717位上两个半胱氨酸残基位上两个半胱氨酸残基是细胞色是细胞色素素C C与辅基血红素共价相连的位置；与辅基血红素共价相连的位置；第第70-8070-80位上成串的不变氨基位上成串的不变氨基酸残基酸残基可能是细胞色素可能是细胞色素C C与酶结合的部位。与酶结合的部位。在分子进化过程中，细胞色素在分子进化过程中，细胞色素C C分子中保持氨基酸残基不分子中保持氨基酸残基不变的区域称为变的区域称为保守部位保守部位。保守部位的氨基酸都是细

9、胞色保守部位的氨基酸都是细胞色素素C C完成其生物学功能所必需的完成其生物学功能所必需的。第11页，讲稿共71张，创作于星期三同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质同源蛋白质：在生物体中行使相同或相似功能的蛋在生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。白质。不变残基不变残基 可变残基可变残基来自两个物种的同源蛋白质，其序列之间的氨基酸来自两个物种的同源蛋白质，其序列之间的氨基酸差异数目与这些物种间的系统差异成比例。即在进差异数目与这些物种间的系统差异成比例。即在进化位置上相差愈远，其氨基酸序列差别愈大。化位置上相差愈远，其氨基酸序列差别愈大。第12页，讲稿共71张，创

10、作于星期三4.蛋白质的一级结构与蛋白质的一级结构与分子病分子病 几乎所有遗传病都与蛋白质几乎所有遗传病都与蛋白质分子结构改变分子结构改变有关，称之为有关，称之为分子病分子病。在蛋白在蛋白质的一级结构中，参与质的一级结构中，参与功能活性部位的残基功能活性部位的残基或或处于特定构象关键部位的处于特定构象关键部位的残基残基，即使在整个分子中发生，即使在整个分子中发生一个残基的异常一个残基的异常，那么该蛋白质的功能也会，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响，导致疾病的发生。受到明显的影响，导致疾病的发生。这种变异来源于基因上遗传信息的突这种变异来源于基因上遗传信息的突变，所以是可变，所以是可遗传遗传的

11、的。与血红蛋白相关与血红蛋白相关与血红蛋白相关与血红蛋白相关的分子病的分子病的分子病的分子病镰刀状细胞贫血病镰刀状细胞贫血病-血红蛋白血红蛋白 或或 链突变链突变地中海贫血地中海贫血-血红蛋白血红蛋白 或或 链缺失链缺失第13页，讲稿共71张，创作于星期三 被称之为被称之为“分子病分子病”的的镰刀状细胞贫血镰刀状细胞贫血仅仅是血红蛋白（仅仅是血红蛋白（HbHb）亚亚基基574574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基即个氨基酸残基中，一个氨基酸残基即N N端的第端的第6 6位的谷氨酸被缬位的谷氨酸被缬氨酸取代，发生了变异所造成的。突变导致本是可溶性的血红蛋白聚氨酸取代，发生了变异所造成的。突变导致本

12、是可溶性的血红蛋白聚集成丝，相互粘着，导致红细胞变形而成镰刀状，极易破碎导致贫血。集成丝，相互粘着，导致红细胞变形而成镰刀状，极易破碎导致贫血。镰刀状细胞贫血病镰刀状细胞贫血病血红蛋白分子病血红蛋白分子病第14页，讲稿共71张，创作于星期三地中海贫血地中海贫血产生原因：产生原因：n缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因；缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因；n一个或多个基因无义突变缩短的蛋白链；发生移码突变不能合一个或多个基因无义突变缩短的蛋白链；发生移码突变不能合成正确的多肽链；成正确的多肽链；n编码区外突变转录阻断或编码区外突变转录阻断或mRNA不能正确加工。不能正确加工。类型：类型：-地中海贫

13、血地中海贫血-地中海贫血地中海贫血第15页，讲稿共71张，创作于星期三(二二)蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质多种多样的蛋白质多种多样的功能功能与各种蛋白质特定的与各种蛋白质特定的空间构象空间构象密切相密切相关，蛋白质的关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化，其功，构象发生变化，其功能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。在生物体内，

14、当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的现象称为蛋白质的别构效应别构效应(allostery)allostery)。蛋白质蛋白质(或酶或酶)的别构效的别构效应，在生物体内普遍存在，这对物质代谢的调节和某些生理功能应，在生物体内普遍存在，这对物质代谢的调节和某些生理功能的变化都是十分重要的。的变化都是十分重要的。第16页，讲稿共71张，创作于星期三1、肌红蛋白、肌红蛋白MyoglobinMyoglo

15、bin（Mb）结构与功能结构与功能肌红蛋白：主要肌红蛋白：主要肌细胞肌细胞贮存和分配贮存和分配氧氧的蛋白质。肌红蛋白是由一的蛋白质。肌红蛋白是由一条多肽条多肽链链和和一个辅基血红素（原卟啉一个辅基血红素（原卟啉IX和和Fe的络合物）的络合物）组成，除去血红素组成，除去血红素的脱辅基肌红蛋白称珠蛋白的脱辅基肌红蛋白称珠蛋白（globin），），它和血红蛋白的亚它和血红蛋白的亚基在氨基酸序列上有明显的同源性，基在氨基酸序列上有明显的同源性，构象和功能也相似，由构象和功能也相似，由8个个-螺旋组螺旋组成。成。第17页，讲稿共71张，创作于星期三氧气与肌红蛋白的结合氧气与肌红蛋白的结合第18页，讲稿共

16、71张，创作于星期三nO2与与CO竞争结合血红蛋白和肌红蛋白；竞争结合血红蛋白和肌红蛋白；n空气中空气中CO的含量达到的含量达到0.06-0.08%即有中毒即有中毒的危险，达到的危险，达到0.1%时则能窒息死亡；时则能窒息死亡；nO2的结合改变肌红蛋白的构象，但对肌红的结合改变肌红蛋白的构象，但对肌红蛋白的功能影响不大。蛋白的功能影响不大。构型（构型（configurationconfiguration）：）：分分L L、D D型，改变时有共价键的断型，改变时有共价键的断裂。裂。构象（构象（conformationconformation）：）：改变无须有共价键的断裂，只是改变无须有共价键的断

17、裂，只是次级键断裂。次级键断裂。第19页，讲稿共71张，创作于星期三2、血红蛋白、血红蛋白(hemoglobin,Hb)结构结构与功能与功能 4 4个亚基个亚基组成，两组成，两两相同，每个亚基两相同，每个亚基都有一个血红素基都有一个血红素基和一个氧结合部位。和一个氧结合部位。Hb Hb分子分子近似球形近似球形，4 4个亚基占据相当于个亚基占据相当于四面体的四个顶角。四面体的四个顶角。第20页，讲稿共71张，创作于星期三辅基血红素（辅基血红素（heme）n氧与蛋白不能直接结合；氧与蛋白不能直接结合；n借助过渡金属的低氧态（借助过渡金属的低氧态（Fe2）和有机分子原卟啉）和有机分子原卟啉IX；n卟

18、啉化合物着色力强，血红蛋白的铁卟啉使血液呈红色；卟啉化合物着色力强，血红蛋白的铁卟啉使血液呈红色；n原卟啉原卟啉IX和和Fe的络合物成为血红素（的络合物成为血红素（heme）。）。第21页，讲稿共71张，创作于星期三O2 血血红红素素与与氧氧结结合合后后，铁铁原原子子半半径径变变小小，就就能能进进入入卟卟啉啉环环的的小小孔孔中中，继继而而引引起起肽肽链链位位置的变动。置的变动。卟啉平面卟啉平面卟啉平面卟啉平面FeFe第22页，讲稿共71张，创作于星期三nHbHb与与MbMb一一样样能能可可逆逆地地与与O O2 2结结合合，HbHb与与O O2 2结结合合后后称称为为氧氧合合HbHb。氧氧合合H

19、bHb占总占总HbHb的百分数（称的百分数（称百分饱和度百分饱和度）随）随O O2 2浓度变化而改变。浓度变化而改变。n血血红红蛋蛋白白存存在在两两种种主主要要构构象象态态：T T态态（tense tense statestate）和和R R态态（relaxed relaxed statestate），T T态态和和R R态态之之间间能能互互换换，而而且且均均能能结结合合氧氧，但但R R态的结合能力要强。态的结合能力要强。n作作为为T T态态的的去去氧氧血血红红蛋蛋白白有有专专一一性性的的氢氢键键和和盐盐桥桥起起着着稳稳定定作作用用，4 4个个亚基的亚基的C C末端处于受束缚的状态。末端处于受

20、束缚的状态。n血红蛋白除运输氧外，还运输血红蛋白除运输氧外，还运输H和和CO2。血红蛋白的构象变化与结合氧血红蛋白的构象变化与结合氧第23页，讲稿共71张，创作于星期三肌红蛋白与血红蛋白结构和功能的比较肌红蛋白与血红蛋白结构和功能的比较结构 共同点 差异：肌红蛋白只有三级结构，具有一条多肽链，血红蛋白具有四 级结构，含有四个亚基功能共同点：均可与氧可逆结合差异：肌红蛋白只能贮备氧，而血红蛋白可以运输氧，此外也可运输H+和CO2球状蛋白质球状蛋白质肌红蛋白的一级结构与血红蛋白的肌红蛋白的一级结构与血红蛋白的 亚基或亚基或 亚基极为相似亚基极为相似第24页，讲稿共71张，创作于星期三肌红蛋白肌红蛋

21、白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线肌红蛋白肌红蛋白肌红蛋白肌红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白 血红蛋白氧合曲血红蛋白氧合曲线为线为 S 形形 肌红蛋白氧合肌红蛋白氧合曲线为曲线为双曲线形双曲线形第25页，讲稿共71张，创作于星期三Hb THb T态和态和R R态互变态互变HbHb氧合与脱氧构象转换示意氧合与脱氧构象转换示意第26页，讲稿共71张，创作于星期三Hb与与O2的结合或解离曲线呈的结合或解离曲线呈S型与型与Hb的的变构效应有关。变构效应有关。nHb与与O2结合盐键断裂，结合盐键断裂，R型型nHb与与O2解离盐键形成，解离盐键形成，T型型nT型对型对O2

22、亲和力小。亲和力小。nR型对型对O2亲和力大。亲和力大。第27页，讲稿共71张，创作于星期三协同效应协同效应(cooperativity)(cooperativity)u一个一个寡聚体蛋白质寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应协同效应。如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应(positive cooperativity)(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应(neg

23、ative cooperativity)(negative cooperativity)u血红蛋白的氧合具有血红蛋白的氧合具有正协同性同促效应正协同性同促效应，也即一个，也即一个O2的结合增加同的结合增加同一一Hb分子中其余空的氧结合部位对分子中其余空的氧结合部位对O2的亲和力。的亲和力。第28页，讲稿共71张，创作于星期三变构效应变构效应(allosteric effect)蛋蛋白白质质空空间间结结构构的的改改变变伴伴随随其其功功能能的的变变化化，称称为为变变构构效应效应。HbHb与与O O2 2结结合合后后，HbHb的的构构象象发发生生变变化化，这这类类变变化化称称为为变变构构效效应应，即

24、即通通过过构构象象变变化化影影响响蛋蛋白白质质的的功功能能，HbHb称称为为变变构蛋白构蛋白（allosteric proteinallosteric protein）。）。第29页，讲稿共71张，创作于星期三(R)relaxed state(T)tense state 血液中血液中O2的的运输运输 (Hb R/T(Hb R/T态的互换态的互换)Lung氧氧分分子子HemoglobinMyoglobinMuscle静脉静脉动脉动脉环境氧浓度高时环境氧浓度高时Hb 快速吸收氧分子快速吸收氧分子环境氧浓度低时环境氧浓度低时Hb 迅速释放氧气迅速释放氧气任何一个亚基接受任何一个亚基接受O O2 2后

25、，会增加其他亚基吸收后，会增加其他亚基吸收O O2 2的能力的能力释放氧气后释放氧气后Hb 变回变回 T state第30页，讲稿共71张，创作于星期三2,3 BPG的作用的作用2,3 BPG是血红蛋白的是血红蛋白的别构效应剂别构效应剂，一分子血红蛋白只有一分子，一分子血红蛋白只有一分子2,3 BPG，位于由四个亚基缔合形成的中央孔穴内。位于由四个亚基缔合形成的中央孔穴内。2,3 BPG将两个链交联在一起，有将两个链交联在一起，有助于去氧血红蛋白的构象，促进氧的释放助于去氧血红蛋白的构象，促进氧的释放。第31页，讲稿共71张，创作于星期三q 2,3-二磷酸二磷酸-D-甘油酸（甘油酸（2,3BP

26、G）是红细胞）是红细胞内血红蛋白的别构效应剂。内血红蛋白的别构效应剂。q 2,3BPG 的存在，可使氧与全血中成熟的血红的存在，可使氧与全血中成熟的血红蛋白结合的蛋白结合的P50大约提高到大约提高到26torr。q 换言之，红细胞中的换言之，红细胞中的2,3BPG实质上是降低实质上是降低了脱氧血红蛋白对氧的亲和性。了脱氧血红蛋白对氧的亲和性。q在红细胞中，在红细胞中，2,3BPG与血红蛋白的浓度几乎与血红蛋白的浓度几乎是等摩尔的。是等摩尔的。第32页，讲稿共71张，创作于星期三 肺中肺中pO2（海平面）（海平面）肺中肺中pO2(高高原原4500米米)组织中组织中 pO2氧氧饱饱和和度度2,3-

27、二磷酸二磷酸-D-甘油酸甘油酸（2,3 BPG）对血红蛋白）对血红蛋白氧合曲线的影响氧合曲线的影响 当人从海平面上到当人从海平面上到4500米高原后两天内，米高原后两天内，2,3 BPG的浓度有原来的的浓度有原来的5mM增加到增加到8mM，结果，结果对组织的供氧量又恢复对组织的供氧量又恢复到接近正常水平（到接近正常水平（0.38）。）。如果如果BPG仍维持仍维持5mM水平，对组织的供氧量将减水平，对组织的供氧量将减少四分之一，为少四分之一，为0.30。第33页，讲稿共71张，创作于星期三 波耳效应波耳效应 （Bohr effect）pH对氧饱和曲线的影对氧饱和曲线的影响响第34页，讲稿共71张

28、，创作于星期三 氧氧结结合合血血红红蛋蛋白白的的另另外外调调节节作作用用涉涉及及到到二二氧氧化化碳碳和和质质子子，二二者者都都是是有有氧氧代代谢谢的的产产物物。CO2能能降降低低血血红红蛋蛋白白对对氧氧的的亲亲和和性性。在在红红细细胞胞内内碳碳酸酸酐酐酶酶催催化化CO2生生成成一一个个碳碳酸酸（H2CO3），碳碳酸酸容容易易解解离离形形成成碳碳酸酸氢氢根根离离子子和和一一个质子：个质子：CO2H2O HHCO3结结果果使使得得细细胞胞内内的的pH降降低低。低低pH 导导致致血血红红蛋蛋白白中中的的几几个个基基团团的的质质子子化化，质子化的基团可以形成有助于脱氧构象稳定的离子对质子化的基团可以形

29、成有助于脱氧构象稳定的离子对。CO2浓浓度度增增加加以以及及相相应应的的pH降降低低使使得得血血红红蛋蛋白白的的P50升升高高，这这一一现现象象称称之之波波耳耳效效应应（Bohr effect），它它提提高高了了氧氧转转运运系系统统的的效效率率。在在肺肺部部，CO2水水平平低低，氧氧很很容容易易被被血血红红蛋蛋白白占占有有，同同时时释释放放出出质质子子；而而在在代代谢谢的的组组织织中中，CO2水水平平相相对对来来说说比比较较高高，pH较较低低，O2容容易易从从氧氧合合血血红红蛋蛋白白中中卸载。卸载。第35页，讲稿共71张，创作于星期三3 3、蛋白质构象改变与疾病、蛋白质构象改变与疾病 蛋蛋白白

30、质质构构象象疾疾病病：若若蛋蛋白白质质的的折折叠叠发发生生错错误误，尽尽管管其其一一级级结结构构不不变变，但但蛋蛋白白质质的的构构象象发发生生改改变变，仍仍可可影影响响其其功功能能，严严重重时时可可导导致致疾病发生。疾病发生。第36页，讲稿共71张，创作于星期三蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。维沉淀的病理改变。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓

31、变性病、老年痴：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。第37页，讲稿共71张，创作于星期三疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一引起的一组人和动物神经退行性病变。组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第38页，讲稿共71张，

32、创作于星期三 一条肽链对应一个一条肽链对应一个特定的空间结构。特定的空间结构。这条法则的破坏是灾这条法则的破坏是灾难性的。疯牛病的难性的。疯牛病的prion就是一个例子就是一个例子。正常正常prion异常异常prion蛋白质构象改变与疾病第39页，讲稿共71张，创作于星期三老年性痴呆老年性痴呆（AD,Alzheimeis disease）老年性痴呆老年性痴呆:即阿尔茨海默病，是一种大脑细胞即阿尔茨海默病，是一种大脑细胞退化萎缩，细胞密度降低的器质性疾病。退化萎缩，细胞密度降低的器质性疾病。主要症状：主要症状：部分或者全部的丧失记忆能力和部分或者全部的丧失记忆能力和认识能力。认识能力。同样是蛋白

33、质构象变化引起的疾病，与淀粉同样是蛋白质构象变化引起的疾病，与淀粉样纤维沉积有关。现在已知，这种纤维的形样纤维沉积有关。现在已知，这种纤维的形成是由于一种特征性交联的成是由于一种特征性交联的-Sheet-Sheet结构的有结构的有序排列，且序排列，且-Sheet-Sheet结构的每一条链与纤维结构的每一条链与纤维的长轴垂直。的长轴垂直。第40页，讲稿共71张，创作于星期三根据分子外形的对称程度分根据分子外形的对称程度分n球状蛋白（球状蛋白（globular protein）：亲水基团位于分子表面，疏水基：亲水基团位于分子表面，疏水基团位于分子内部，形状接近球形或椭球形，易溶于水，如血清团位于分

34、子内部，形状接近球形或椭球形，易溶于水，如血清球蛋白和肌球蛋白等。球蛋白和肌球蛋白等。n纤维状蛋白纤维状蛋白（fibrous protein）：具有比较简单、有规则的线性结：具有比较简单、有规则的线性结构，呈细棒或纤维状，难溶于水和稀盐溶液，如胶原蛋白、弹性蛋白、构，呈细棒或纤维状，难溶于水和稀盐溶液，如胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白和角蛋白等。丝蛋白和角蛋白等。根据蛋白质的生物学功能分根据蛋白质的生物学功能分酶、运输蛋白质、营养和贮存蛋白质、收缩蛋白质和结构蛋酶、运输蛋白质、营养和贮存蛋白质、收缩蛋白质和结构蛋白质等。白质等。第41页，讲稿共71张，创作于星期三第42页，讲稿共71张，创作于星期

35、三一、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活总目标：增加制品纯度或比活1.1.前处理：因动前处理：因动/植物植物/细菌而异细菌而异2.2.粗分级分离：采用盐析粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀等电点沉淀/有机有机溶剂分级分离等方法溶剂分级分离等方法3.3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等吸附层析以及亲和层析等4.4.结晶结晶第43页，讲稿共71张，创作于星期三二、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤、透析和超过滤w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其利用蛋白质

36、分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开与小分子物质分开w半透膜为玻璃纸或纤维素材料半透膜为玻璃纸或纤维素材料第44页，讲稿共71张，创作于星期三五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤、透析和超过滤w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开与小分子物质分开w半透膜为玻璃纸或纤维素材料半透膜为玻璃纸或纤维素材料第45页，讲稿共71张，创作于星期三透析透析支持膜的栅板加压蛋白质溶液半透膜超滤液超过滤超过滤第46页，讲稿共71张，创作于星期三2 2、密度梯度（区带）离心、密度梯度（区带）离心600

37、0080000转/分重力60万80万倍第47页，讲稿共71张，创作于星期三3、凝胶过滤、凝胶过滤第48页，讲稿共71张，创作于星期三（二）利用溶解度差别的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法 1.1.等电点沉淀等电点沉淀 调整溶液调整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI处依次沉淀处依次沉淀 2.2.盐溶和盐析盐溶和盐析3.3.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法w降低介电常数降低介电常数w争夺水化膜争夺水化膜第49页，讲稿共71张，创作于星期三原理：原理：蛋白质在非等电点时所带总电荷不为蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 0分子大小不同，电场中移动速度也不同分子大小不同，电场中移动速

38、度也不同(三三)利用电荷差别纯化的方法利用电荷差别纯化的方法利用电荷差别纯化的方法利用电荷差别纯化的方法第50页，讲稿共71张，创作于星期三几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子，常用于蛋白质分子量的测定。量的测定。*等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。是蛋白质组学研究的重要技术。第51页，讲稿共71张，创作于星期三十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基磺酸基 极性亲水极性亲水烷基

39、烷基 亲油亲油（蛋白质疏水区）（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键第52页，讲稿共71张，创作于星期三第53页，讲稿共71张，创作于星期三第54页，讲稿共71张，创作于星期三第55页，讲稿共71张，创作于星期三等电聚焦电泳等电聚焦电泳等电聚焦等电聚焦等电聚焦等电聚焦第56页，讲稿共71张，创作于星期三双向电泳双向电泳双向电泳双向电泳双向电泳双向电泳第57页，讲稿共71张，创作于星期三离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析第58页，讲稿共71张，创作于星期三（四）利用蛋白质选择

40、性吸附的性质（四）利用蛋白质选择性吸附的性质羟磷石灰层析羟磷石灰层析疏水作用层析疏水作用层析第59页，讲稿共71张，创作于星期三（五）利用对配体的特异生物学（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒亲和色谱颗粒具有极强的专一性具有极强的专一性第60页，讲稿共71张，创作于星期三第61页，讲稿共71张，创作于星期三六、蛋白质含量测定和纯度鉴定（一）测定蛋白质总量（一）测定蛋白质总量1、凯氏定氮法、凯氏定氮法2、双缩脲法、双缩脲法3、Folin-酚试剂法酚试剂法 4、BCA 法（法（4,4-二羧二羧-2,2-二喹啉二喹啉 bicinchoninic acid）5、B

41、radford法法 6、胶体金法、胶体金法7、紫外吸收法、紫外吸收法 物理性质物理性质物理性质物理性质化学性质化学性质化学性质化学性质第62页，讲稿共71张，创作于星期三（二）测定蛋白质混合物中某一特定（二）测定蛋白质混合物中某一特定 蛋白质的含量蛋白质的含量（三）鉴定蛋白质制品的纯度（三）鉴定蛋白质制品的纯度 1.电泳分析电泳分析 2.沉淀分析沉淀分析 3.扩散分析扩散分析 第63页，讲稿共71张，创作于星期三第七节第七节蛋白质测序蛋白质测序第64页，讲稿共71张，创作于星期三（1）英国科学家英国科学家Sanger测序测序（20世纪世纪50年代）。年代）。（2）建立色谱技术和定量氨基酸分析技

42、术建立色谱技术和定量氨基酸分析技术（20世纪世纪50年代）。年代）。（3）Edman降解降解（20世纪世纪70年代出现）。年代出现）。仪仪器器自自动动化化：液液相相自自动动测测序序仪仪和和固固相相蛋蛋白白质质自自动动测测序序仪仪。进进入入20世世纪纪80年年代代，气气相相测测序序技技术术出出现现并并实实现现了了仪仪器器自自动动化化。灵灵敏敏度度显显著著提提高高，样样品品量量只只需需10pmol以以下下，一一次次连连续续测测定定的的顺顺序序甚甚至至可可超超过过80个个残残基基。样样品品处处理理远远比比固固相相方方法简单和操作方便。法简单和操作方便。（4）20世世纪纪70年年代代，华华裔裔学学者者

43、张张瑞瑞耀耀提提出出的的有有色色Edman试试剂剂DABITC，使手工测序技术更加灵敏可靠使手工测序技术更加灵敏可靠。蛋白质测序的发展：蛋白质测序的发展：第65页，讲稿共71张，创作于星期三（5 5）对对2-2-D D胶胶上上的的点点进进行行测测序序：将将蛋蛋白白质质转转印印到到PVDFPVDF（聚聚偏偏二二氟氟乙乙烯烯）膜膜上上，然然后后将将膜膜片片放放入入测测序序仪仪的的反反应应室室中中进进行行EdmanEdman降解。降解。（6 6）毛毛细细管管电电泳泳技技术术（2020世世纪纪9090年年代代发发展展起起来来的的微微量量分分析析技技术术）的的采采用用，是是蛋蛋白白质质N N端端微微量量

44、顺顺序序测测定定方方法法学学一一个个引引人人注注目目的的发发展展。其其灵灵敏敏度度比比HPLCHPLC高高两两个个数数量量级级。可可在在1010fmolfmol的的水水平平检检测测氨氨基基酸酸。微微型型测测序序仪仪与与毛毛细细管管电电泳泳联联用用的的微微量量蛋蛋白白质质测测序序方方法法已已经经呈呈现现很很好的前景。好的前景。第66页，讲稿共71张，创作于星期三（7）蛋蛋白白质质C端端测测序序：C端端测测序序的的重重要要性性：为为PCR扩扩增增出出某某一一蛋蛋白白的的完完整整基基因因提提供供合合成成C端端引引物物的的重重要要依依据据；以以及及为为基基因因表表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据达的蛋白

45、质的鉴定提供关键的证据等。等。最最成成功功的的方方法法是是在在Schlack早早年年提提出出的的异异硫硫氰氰酸酸法法的的基基础础上上发展起来的。发展起来的。直直到到20世世纪纪90年年代代初初由由于于发发展展出出一一些些新新的的偶偶联联和和裂裂解解试试剂剂，配配合合用用HPLC对对乙乙酰酰内内硫硫脲脲氨氨基基酸酸（TH）的的鉴鉴定定，该该方方法法才才得得以以较较快快地地发发展展。目目前前已已有有自自动动化化C端端测测序序仪仪，能能常常规规地地进行进行6-8个残基的个残基的C端顺序测定。端顺序测定。第67页，讲稿共71张，创作于星期三（8）质谱法用于蛋白质顺序测定：质谱法用于蛋白质顺序测定：必必

46、要要性性：DNA顺顺序序测测定定解解决决不不了了翻翻译译后后加加工工所所导导致致的的氨氨基基酸酸残残基基的的修修饰饰问问题题，Edman降降解解不不能能解解决决N端端封封闭闭肽肽的的测测序序问问题题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。而质谱法能使上述问题迎刃而解。20世世纪纪80年年代代初初出出现现快快原原子子轰轰击击质质谱谱（FAB质质谱谱）能能准准确确确确定定的的分分子子量量达达到到数数千千。相相继继发发展展的的串串行行质质谱谱可可以以把把FAB得得到到的的分分子子、离离子子进进行行再再一一次次惰惰性性原原子子轰轰击击，使使肽肽链链在在不不同同部部位位断断裂裂从从而而得得到到一一组组片片段段的

47、的质质谱谱信信息息，使使多多肽肽顺顺序序测测定定得得以以实现。实现。第68页，讲稿共71张，创作于星期三 20世世纪纪80年年代代末末出出现现了了电电喷喷雾雾质质谱谱和和基基质质辅辅助助激激光光解解吸吸电电离离-飞飞行行时间质谱时间质谱。电电喷喷雾雾质质谱谱测测定定分分子子量量数数万万的的蛋蛋白白质质准准确确度度可可达达万万分分之之一一，主主要要优优点点是是可可与与HPLC仪仪实实现现液液质质联联用用，因因而而能能使使一一个个蛋蛋白白质质的的酶酶解解产产物物在在得得到到HPLC肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。飞行时间质谱飞行时间质谱能对分子量达能对分子量达3

48、0万道尔顿的分子进行准确质谱分析。误差万道尔顿的分子进行准确质谱分析。误差率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学结构分析已呈现极大率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学结构分析已呈现极大应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的应用可成功地进行蛋白质应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的应用可成功地进行蛋白质C端端与与N端的顺序测定，该方法一个显著的优点是用端的顺序测定，该方法一个显著的优点是用样品量极微样品量极微（1-2pmol），），且非常快速，每次质谱分析只需数分钟。且非常快速，每次质谱分析只需数分钟。第69页，讲稿共71张，创作于星期三（9）质质谱谱技技术术不不能能完完全全取取代代Edman降降解解与与其其他他蛋蛋白白质质分分析析方方法法。通常是联合运用这些技术。通常是联合运用这些技术。（10）蛋白质测序展望：蛋白质测序展望：N端测序仪在灵敏度上还需提高。端测序仪在灵敏度上还需提高。C端测序技术需要更新型的偶联试剂和更有效的裂解方法。端测序技术需要更新型的偶联试剂和更有效的裂解方法。质谱技术将有令人刮目相看的作为。质谱技术将有令人刮目相看的作为。一一些些新新的的分分析析技技术术很很可可能能进进入入蛋蛋白白质质序序列列分分析析领领域域，如如多多维维核磁共振方法。核磁共振方法。第70页，讲稿共71张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第71页，讲稿共71张，创作于星期三