蛋白质分子的化学修饰精选PPT.ppt

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1、关于蛋白质分子的化学修饰第1页，讲稿共88张，创作于星期三第一节第一节 酶的活性中心酶的活性中心第二节第二节 酶化学修饰的目的酶化学修饰的目的第三节第三节 酶化学修饰的原理酶化学修饰的原理第四节第四节 酶化学修饰的设计酶化学修饰的设计第五节第五节 酶化学修饰的应用酶化学修饰的应用第六节第六节 酶的蛋白质工程酶的蛋白质工程第2页，讲稿共88张，创作于星期三 第一节第一节 酶的活性中心（酶的活性中心（active siteactive site）一、活性中心的概念一、活性中心的概念vv酶的必需基团酶的必需基团(essential group):(essential group):与酶活性有关的基团

2、与酶活性有关的基团vv酶的活性中心酶的活性中心酶的活性中心酶的活性中心(active center):(active center):由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.第3页，讲稿共88张，创作于星期三酶酶分分子子非必需基团非必需基团必需基团必需基团活性中心活性中心必需基团必需基团活性中心外活性中心外必需基团必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团非活性中心非活性中心活活性性中中心心第4页，讲稿共88张，创作于星期三活性中心的重要化学基团活性中心的重要化学基团

3、 7 7种氨基酸出现的频率最高种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr SerLys Asp Glu Cys His Tyr Ser 某些功能基团某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。和咪唑基）是酶的必需基团。赖氨酸的氨基赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基酪氨酸和丝氨酸的羟基第5页，讲稿共88张，创作于星期三OH第6页，讲稿共88张，创作于星期三第7页，讲稿共88张，创作于星期三活性部位只占酶分子很小的一

4、部分活性部位只占酶分子很小的一部分第8页，讲稿共88张，创作于星期三胰凝乳蛋白酶 第9页，讲稿共88张，创作于星期三活性部位是一个三维实体活性部位是一个三维实体第10页，讲稿共88张，创作于星期三二、活性中心的共性二、活性中心的共性(1)(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%1-2%）。）。(2)(2)活性部位是一个三维实体。活性部位是一个三维实体。(3)(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。(4)(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。(5)(5)酶与底物通过盐键

5、、氢键、范德华力和疏水作用等次酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。级键结合。第11页，讲稿共88张，创作于星期三 酶的稳定性酶的稳定性 1.1.酶稳定的分子原因酶稳定的分子原因 1 1）共价键：）共价键：肽键（肽键（peptide bondpeptide bond）稳定蛋白质和酶主链的核心力量。稳定蛋白质和酶主链的核心力量。二硫键（二硫键（disulfide bonddisulfide bond）由两个由两个CysCys的侧链的侧链-SH-SH氧化而成，是某些蛋白氧化而成，是某些蛋白质维持结构稳定性的主要因素。质维持结构稳定性的主要因素。第12页，讲稿共88张，创作于星期三

6、2 2）非共价键：）非共价键：疏水相互作用（疏水相互作用（hydrophobic interactionhydrophobic interaction）:是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。氢键（氢键（hydrogen bondhydrogen bond）：）：是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构的重要力是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构的重要力量。量。第13页，讲稿共88张，创作于星期三静电相互作用（静电相互作用（electrostatic interactionelectrostatic interaction）：）：又称离子键、盐键、盐桥

7、，是正负电荷间的作用又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表面上。面上。范德华力：范德华力：在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的范德华力越大越稳定。范德华力越大越稳定。金属离子：金属离子：Ca2+Ca2+、MgMg2+2+和和ZnZn2+2+等高价阳离子与多肽链不稳定的弯等高价阳离子与多肽链不稳定的弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。第14页，讲稿共88张，创作于星期三途径方法优点不足酶分子改造核酸水平蛋白质工程

8、从根本上提高酶分子稳定性操作复杂，周期长蛋白质水平化学修饰适应所有酶，操作简单经济修饰过程破坏酶分子剂型固定化适应所有酶，稳定性高，可重复利用和连续生产载量较低，易失活交联酶晶体稳定性好，载量高，催化效率高成本高微环境改良稳定剂简单、经济工作量大反应介质适用于特殊反应体系和酶类适合的酶类还不普遍2.稳定酶的方法稳定酶的方法第15页，讲稿共88张，创作于星期三 三、研究酶活性中心的方法三、研究酶活性中心的方法 1.1.物理学方法：物理学方法：用用X X射线衍射法直接检测底物或其类似射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置

9、。的相对位置。第16页，讲稿共88张，创作于星期三2.2.化学修饰法：化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为根据所用修饰试剂不同，分为 1)1)非专一性化学修饰非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若某基团被修饰后：若某基团被修饰后：酶活性不变酶活性不变该基团可能不是酶的必需基团该基团可能不是酶的必需基团酶活性降低或丧失酶活性降低或丧失该基团可能是酶的必需基团该基团可能是酶的必需基团但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。第17页，讲稿共88张，创作于星期三活性中心基团的鉴定

10、标准活性中心基团的鉴定标准 失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。S S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。先加先加S S或竞或竞 加共价修饰剂加共价修饰剂 透析除透析除去去S S或竞或竞 活性不丧失活性不丧失第18页，讲稿共88张，创作于星期三差别标记：差别标记：底物或抑制剂存在底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用活性基团不与修饰剂作用 去除底物或抑制剂去除底物或抑制剂 原来被保护的基团带同位素标记原来被保护的基团带同位素标记 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。化学修饰化学

11、修饰含同位素标记含同位素标记 的同样试剂的同样试剂第19页，讲稿共88张，创作于星期三2)2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）专一性化学修饰（基团专一性修饰）用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。基酸残基的侧链基团。3)3)亲和标记（位点专一性修饰）亲和标记（位点专一性修饰）采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。有活泼反应基团的底物类似物。作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。记。第20页，

12、讲稿共88张，创作于星期三化学修饰的专一性化学修饰的专一性第21页，讲稿共88张，创作于星期三亲和修饰剂：亲和修饰剂：与与S S结构相似结构相似，与活性中心的氨基酸残基，与活性中心的氨基酸残基 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。残基亲和力小。具有活泼的化学基团具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性（如卤素）可与活性 中心的基团形成稳定的共价键。中心的基团形成稳定的共价键。第22页，讲稿共88张，创作于星期三3.3.蛋白质工程：蛋白质工程：将酶相应的将酶相应的cDNAcDNA定点突变，突变的定点突变，突变的cDNAcDNA只表达一个或几个氨基酸被置

13、换的只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。酸是否为活力所必需。第23页，讲稿共88张，创作于星期三 第二节第二节 酶化学修饰及修饰目的酶化学修饰及修饰目的 一、酶化学修饰一、酶化学修饰 1.1.限制酶大规模应用的原因：限制酶大规模应用的原因：第24页，讲稿共88张，创作于星期三 酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。因此，日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和比拟的。因此，日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和预防、环境保护和监测、化

14、工产品的生产，以及基因工程等生物预防、环境保护和监测、化工产品的生产，以及基因工程等生物技术领域。技术领域。但是但是酶在实际应用中有酶在实际应用中有局限性局限性：1 1、作为异体蛋白在体内作为异体蛋白在体内难于吸收难于吸收、易引起、易引起免疫反应免疫反应和和被识别降解被识别降解(具有抗原性具有抗原性)；2 2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，半衰期短、半衰期短、易变性失活易变性失活(细胞外稳定性差细胞外稳定性差)；3 3、酶的活性、作用专一性和最适条件酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，不一定能适应生产工艺要求，限

15、制了酶制剂的应用范围限制了酶制剂的应用范围(酶活性不够高酶活性不够高)。第25页，讲稿共88张，创作于星期三2.2.改变酶特性有两种主要的方法改变酶特性有两种主要的方法：1)1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。天然酶的活性。2)2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。因而达到改造酶的目的。第26页，讲稿共88张，创作于星期三 3.酶化学修饰的概念酶化学修饰的概念 （原理（原理 、方法、应用）、方法、应用）酶的化学修饰（酶的化学修饰（chemical modificationchemica

16、l modification）：）：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。酶选择性化学修饰：酶选择性化学修饰：肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰 化学修饰方法虽

17、多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，基团特性，或直接或经过一定的活化过程或直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。行改造。第27页，讲稿共88张，创作于星期三二、酶化学修饰的目的二、酶化学修饰的目的 1.1.研究酶的结构与功能的关系。（研究酶的结构与功能的关系。（5050年代末）年代末）2.2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范

18、围。（范围。（7070年代末之后）年代末之后）1 1）提高酶的生物活性（酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。2 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4 4）产生新的催化能力。）产生新的催化能力。第28页，讲稿共88张，创作于星期三 第三节第三节 酶化学修饰的原理酶化学修饰的原理 凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价结构发生凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价结构发生改变改变（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分（侧链基团的取

19、代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联），子间的交联），都可称为蛋白质的化学修饰。都可称为蛋白质的化学修饰。达到：达到：改造酶的作用特性改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、对效（包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性能及对辅助因子的要求）应物响应性能及对辅助因子的要求）提高酶的稳定性提高酶的稳定性扩大在体内应用可能性扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一性水解、减（防止在体内非专一性水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用）少和消除免疫原性以利于医疗应用）第29页，讲稿共88张，创作于星期三一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个

20、反应基团，可与酶形修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性刚性”结构。结构。二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖遮盖”了酶的活性部了酶的活性部位位。第30页，讲稿共88张，创作于星期三三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.1.大分子修饰剂产生空间障碍

21、阻挡蛋白水解酶大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。接近酶分子。“遮盖遮盖”酶分子上敏感键免遭酶分子上敏感键免遭破坏。破坏。2.2.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。少了受蛋白水解酶破坏的可能性。第31页，讲稿共88张，创作于星期三四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1.1.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。键。破坏了抗原决定簇破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除抗原性降低乃至消除 “遮盖遮盖”了抗原决定簇了

22、抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合阻碍抗原、抗体结合2.2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成成“缓冲外壳缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。性部位微环境相对稳定。第32页，讲稿共88张，创作于星期三 第四节第四节 酶化学修饰的设计酶化学修饰的设计 一、充分认识酶分子的特性一、充分认识酶分子的特性 包括酶的包括酶的 1.1.活性部位情况活性部位情况 2.2.稳定条件及反应最佳条件稳定条件及反应最佳条件 3.3.侧链基团的化学性质及反应活泼性侧链基团的化学性质及反应活泼性第33页

23、，讲稿共88张，创作于星期三二、二、修饰剂的选择修饰剂的选择 要考虑要考虑 1.1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）分子量）2.2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）的反应活性基团）3.3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件修饰剂上反应基团的活化方法与条件第34页，讲稿共88张，创作于星期三三、反应条件的选择三、反应条件的选择 要注意要注意 1.1.酶与修饰剂的分子比例酶与修饰剂的分子比例 2.2.反应体系的溶剂性质、盐浓度、反应体系的溶剂性质、盐浓度、pHpH条件条件 3.3.反应

24、温度及时间反应温度及时间第35页，讲稿共88张，创作于星期三第五节第五节 酶化学修饰的种类及应用酶化学修饰的种类及应用 一、酶的表面化学修饰一、酶的表面化学修饰 （一）大分子修饰（大分子结合修饰）（一）大分子修饰（大分子结合修饰）是目前应用最广的酶分子修饰方法。是目前应用最广的酶分子修饰方法。1.1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。性与功能的方法。第36页，讲稿共88张，创作于星期三2.2.修饰剂：修饰剂：聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、右旋糖酐（

25、）、右旋糖酐（dextrandextran）、肝）、肝素（素（heparinheparin）、蔗糖聚合物（）、蔗糖聚合物（FicollFicoll）等。）等。修饰方法：修饰方法：修饰前修饰剂活化修饰前修饰剂活化 一定条件下与酶分子共价结合一定条件下与酶分子共价结合 对酶分子进行修饰。对酶分子进行修饰。第37页，讲稿共88张，创作于星期三3、大分子修饰后酶性质的变化（1）提高酶活力（2）增加酶的稳定性 半衰期：酶活力降低原来活力一半所经过的时间。（3）降低抗原抗体反应 第38页，讲稿共88张，创作于星期三4.4.应用：应用：如：如：PEGPEG超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）PEG

26、PEG溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）PEGPEG天门冬酰胺酶（天门冬酰胺酶（ASNaseASNase）消除了抗原性消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期延长了酶在体内的半衰期又如：用又如：用DextranDextran修饰修饰-淀粉酶，淀粉酶，淀粉酶，胰淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。提高了酶的热稳定性。第39页，讲稿共88张，创作于星期三（二）小分子修饰（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）（酶蛋白侧链基团修饰）定义：定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化

27、学反应。分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。侧链基团修饰剂：侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。采用的各种小分子化合物。2020种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。第40页，讲稿共88张，创作于星期三根据氨基酸侧链根据氨基酸侧链R R基的极性，基的极性，2020种氨基酸可分成种氨基酸可分成4 4类类。1.

28、1.非极性非极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共8 8种）：种）：丙氨酸丙氨酸(Alanine,Ala,A),(Alanine,Ala,A),亮氨酸亮氨酸(Leucine,Leu,L),(Leucine,Leu,L),缬氨酸缬氨酸(Valine,Val,V),(Valine,Val,V),异亮氨酸异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),(Isoleucine,Ile,I),苯丙氨酸苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),(Phenylalanine,Phe,F),色氨酸色氨酸(Tryptophan,Trp,W),(Tryptophan,Trp,W),甲硫氨酸甲硫氨酸(Methi

29、onine,Met,M),(Methionine,Met,M),脯氨酸脯氨酸(Proline,Pro,P)(Proline,Pro,P)第41页，讲稿共88张，创作于星期三2.2.无电荷的极性无电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共7 7种）：种）：丝氨酸丝氨酸(Serine,Ser,S),(Serine,Ser,S),苏氨酸苏氨酸(Threonine,Thr,T),(Threonine,Thr,T),酪氨酸酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺天冬酰胺(Aspar

30、agine,Asn,N),(Asparagine,Asn,N),甘氨酸甘氨酸(Glycine,Gly,G),(Glycine,Gly,G),谷氨酰胺谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)(Glutamine,Gln,Q)3.3.带正电荷的极性带正电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共3 3种）：种）：赖氨酸赖氨酸(Lysine,Lys,K),(Lysine,Lys,K),精氨酸精氨酸(Arginine,Arg,R),(Arginine,Arg,R),组氨酸组氨酸(Histidine,His,H)(Histidine,His,H)4.4.带负电荷的极性带负电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（

31、共（共2 2种）：种）：天冬氨酸天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D),(Aspartic acid,Asp,D),谷氨酸谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)(Glutamic acid,Glu,E)第42页，讲稿共88张，创作于星期三几种重要的修饰反应：几种重要的修饰反应：烷基化反应烷基化反应酰化反应酰化反应氧化还原反应氧化还原反应芳香环取代反应芳香环取代反应第43页，讲稿共88张，创作于星期三1.1.化学修饰反应的类型化学修饰反应的类型 1)1)烷基化反应烷基化反应试试剂剂特特点点：烷烷基基上上带带活活泼泼卤卤素素，导导致致酶酶分分子子的的亲亲核核基基团（如团（如N

32、HNH2 2，-SH-SH等）发生烷基化。等）发生烷基化。可作用基团：可作用基团：氨氨基基（LysLys，ArgArg），巯巯基基（CysCys），羧羧基基（AspAsp、GluGlu），甲甲硫基（硫基（MetMet），咪唑基（），咪唑基（HisHis）。）。修饰剂修饰剂：2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。第44页，讲稿共88张，创作于星期三烷基化反应第45页，讲稿共88张，创作于星期三 2)2)酰基化反应酰基化反应试剂特点：试剂特点：含含有有 结结构构，作作用用于于侧侧链链基基团团上上的的亲亲核核基团，使之酰基化。基团，使之酰基化。可作用基团：可作

33、用基团：氨氨基基，巯巯基基，醇醇羟羟基基（SerSer、ThrThr），酚酚羟羟基基（TyrTyr）第46页，讲稿共88张，创作于星期三酰基化反应 第47页，讲稿共88张，创作于星期三 3)3)氧化和还原反应氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺可可被被氧氧化化的的侧侧链链基基团团：巯巯基基，甲甲硫硫基基，吲吲哚哚基基（Trp）、咪咪唑基，酚基等。唑基，酚基等。还原剂：还原剂：2巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。等。可被还原的侧链基团：二硫键。可被还原的侧链基团：二硫键。第48页，讲稿共88张，创作于星期

34、三连四硫酸盐氧化巯基，连四硫酸盐氧化巯基，DTTDTT还原逆回，用于保护巯基。还原逆回，用于保护巯基。第49页，讲稿共88张，创作于星期三2.2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1)1)氨基的化学修饰：氨基的化学修饰：来源：来源：Lys,Arg,His,GlnLys,Arg,His,Gln修饰反应：酰基化与烷基化修饰反应：酰基化与烷基化酰基化酰基化修饰剂修饰剂:三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）、丹磺酰氯（）、丹磺酰氯（DNSDNS）烷基化烷基化修饰剂修饰剂：2 2，4 4二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、）、碘乙酸、碘乙

35、酰胺、亚硝酸等亚硝酸等第50页，讲稿共88张，创作于星期三第51页，讲稿共88张，创作于星期三2)2)羧基的化学修饰羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。定量测定酶分子中羧基的数目。+水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺第52页，讲稿共88张，创作于星期三3)3)胍基的化学修饰胍基的化学修饰来源：来源：ArgArg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂：修饰剂：丁二酮丁二酮 二羰基化合物二羰基化合物 1 1，2 2环

36、己二酮环己二酮 苯乙二醛苯乙二醛第53页，讲稿共88张，创作于星期三第54页，讲稿共88张，创作于星期三 4)4)巯基的化学修饰巯基的化学修饰 来源：来源：CysCys 修饰反应修饰反应:烷基化烷基化 修饰剂：碘乙酸修饰剂：碘乙酸(IAA)(IAA)碘乙酰胺碘乙酰胺(IAM)(IAM)E-SH+R-X E-SH+R-X E-SR+HX E-SR+HXN-N-乙基马来酰亚胺（乙基马来酰亚胺（NEMNEM）（常用的专一修饰巯基试剂）（常用的专一修饰巯基试剂）E ESH SH 第55页，讲稿共88张，创作于星期三5)5)二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰还原：还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫

37、苏糖醇（DTTDTT）第56页，讲稿共88张，创作于星期三氧化：氧化：过甲酸过甲酸:Performicacid第57页，讲稿共88张，创作于星期三 6)6)咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰 来源：来源：HisHis 修饰反应修饰反应:酰基化与烷基化酰基化与烷基化 酰基化修饰剂酰基化修饰剂:常用焦碳酸二乙酯（常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonatediethyl paracarbonate）+C2H5OH+CO2C2H5OH+CO2 烷基化修饰剂：碘乙酸烷基化修饰剂：碘乙酸+ICH2COOH+HI第58页，讲稿共88张，创作于星期三7 7）酚羟基的化学修饰）酚羟基的化学修饰来

38、源：来源：TyrTyr修饰反应：芳香环取代反应修饰反应：芳香环取代反应修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）第59页，讲稿共88张，创作于星期三 4)4)芳香环取代反应芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂。试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：碘代：I2+HI 硝化：硝化：(NO2)4C+(NO2)3CH（四硝基甲烷）（四硝基甲烷）第60页，讲稿共88张，创作于星期三8 8）吲哚基的化学修饰）吲哚基的化学修饰 来源：来源：TrpTrp 修饰反应：氧化反应修饰反应：氧化反应 修饰剂：修饰剂：N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺第61页，讲稿共88张，创作于星期三氨基

39、酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂LysLys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸AspAsp、GluGlu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺ArgArg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮CysCys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTDTTHisHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸TyrTyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷TrpT

40、rp吲哚基吲哚基N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂第62页，讲稿共88张，创作于星期三酶化学修饰的应用酶化学修饰的应用 在医药方面：在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。和抗原性。在生物技术领域：在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pHpH等酶学等酶学性质。性质。在酶

41、结构功能研究中：在酶结构功能研究中：1.1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.2.确定氨基酸残基的功能；确定氨基酸残基的功能；3.3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。测定酶分子中某种氨基酸的数量。第63页，讲稿共88张，创作于星期三 化学修饰效果举例化学修饰效果举例 用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了高了100100倍倍 用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的NHCHNHCH2 2COOHCOOH

42、后，该酶对后，该酶对60C60C热处理的稳定性增高了热处理的稳定性增高了10001000倍。倍。超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)(superoxide dismutase,SOD)、L L谷氨酰谷氨酰胺酶、胺酶、L L天门冬酰胺酶、尿酸酶等用天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)修饰后，完修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存清除的速度，酶的活力可以保存15154545。第64页，讲稿共88张，创作于星期三酶蛋白

43、化学修饰的局限性酶蛋白化学修饰的局限性1.1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的相对的，很少有对某一，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.2.化学修饰后酶的化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。妨碍对修饰结果的解释。3.3.酶的化学修饰酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用

44、。用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。4.4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需必需”的，的，为什么是必需的，还得用为什么是必需的，还得用X X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。缺乏准确性和系统性。第65页，讲稿共88张，创作于星期三（三）交联修饰（交联法）

45、（三）交联修饰（交联法）用双功能基团试剂用双功能基团试剂(如戊二醛如戊二醛)，与酶分子内不，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。定。（四）固定化修饰（共价偶联法）（四）固定化修饰（共价偶联法）通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适酶的最适pHpH、最适温度和稳定性发生改变。、最适温度和稳定性发生改变。第66页，讲稿共88张，创作于星期三二、酶分子内部修饰二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链

46、有限水解修饰）（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）利用肽链有限水解，使酶的空间结构发生精细利用肽链有限水解，使酶的空间结构发生精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。酶或肽酶为修饰剂）。（与前面化学修饰区别）（与前面化学修饰区别）第67页，讲稿共88张，创作于星期三 酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：三种情况中的一种：1 1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2

47、 2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3 3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。肽链有限水解。第68页，讲稿共88张，创作于星期三修饰后酶性质的变化修饰后酶性质的变化1 1）提高酶活力）提高酶活力2 2）消除抗原性）消除抗原性第69页，讲稿共88张，创作于星期三（二）金属离子置换修饰（二）金属离子置换修饰1、概念、概念 通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功通过改

48、变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。能发生改变的方法。2、作用范围含有金属离子的酶、作用范围含有金属离子的酶 金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。成部分，对酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。入原离子则酶复活。（2）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。使酶呈现不同特性。第70页，讲稿共88张，创作于星期三 3、常用金属离子常用金属离子 （往往

49、是二价离子）（往往是二价离子）:Ca 2+，Mg 2+，Mn 2+，Zn 2+，Co 2+，Cu 2+，Fe 2+等。等。4、方法步骤向酶液加入一定量的方法步骤向酶液加入一定量的EDTA将将酶与金属鳌合物分离金属离子置换。酶与金属鳌合物分离金属离子置换。举例：举例：-淀粉酶发酵生产、保存和应用过程淀粉酶发酵生产、保存和应用过程中添加一定量的钙离子。中添加一定量的钙离子。第71页，讲稿共88张，创作于星期三（三）氨基酸置换修饰（三）氨基酸置换修饰 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。白

50、空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。通过两个途径实现：通过两个途径实现：化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。蛋白质工程：利用基因操作技术。蛋白质工程：利用基因操作技术。第72页，讲稿共88张，创作于星期三酶的蛋白质工程酶的蛋白质工程一、概念：一、概念：蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础结构生物学与生物信息学为基础(结合结合X-衍射分析技术、蛋白衍射分析技术、蛋白质溶液构象理论及计算机辅助设计质溶液构象理论及计算机辅助设计)，以基因重