重组dna技术与基因工程.ppt

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1、关于重组关于重组关于重组关于重组DNADNA技术与基技术与基技术与基技术与基因工程因工程因工程因工程现在学习的是第1页，共56页A 酵母作为表达外源基因受体的特征6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达 酵 母（酵 母（YeastYeast）是 一 群 以是 一 群 以芽 殖芽 殖或或裂 殖裂 殖方 式 进 行方 式 进 行无 性 繁 殖无 性 繁 殖的 单 细 胞的 单 细 胞半知菌类半知菌类（半知酵母半知酵母），共由），共由5656个属、个属、500500多个种组成。如果说大肠多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真杆菌是外源基因最成熟

2、的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。核生物表达系统。酵母的分类学特征酵母的分类学特征真核生物真核生物，分属于，分属于子囊菌纲子囊菌纲（子囊酵母）、（子囊酵母）、担子菌纲担子菌纲（担子酵母（担子酵母）、）、现在学习的是第2页，共56页A 酵母作为表达外源基因受体的特征6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达酵母表达外源基因的优势酵母表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统具

3、有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDAFDA认定为安全的认定为安全的基因工程受体系统（基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRASGenerally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核模式生物现在学习的是第3页，共56页B 酵母的宿主系统6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达提高重组蛋白表达产率的突变宿主

4、提高重组蛋白表达产率的突变宿主抑制超糖基化作用的突变宿主抑制超糖基化作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主广泛用于外源基因表达的酵母宿主广泛用于外源基因表达的酵母宿主现在学习的是第4页，共56页广泛用于外源基因表达的酵母宿主广泛用于外源基因表达的酵母宿主目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母包括：目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母包括：酵母属酵母属 如如酿酒酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）克鲁维酵母属克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（如乳酸克鲁维酵母（Kluyver

5、omyces lactisKluyveromyces lactis）毕赤酵母属毕赤酵母属 如如巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastorisPichia pastoris）裂殖酵母属裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombeSchizosaccharomyces pombe）汉逊酵母属汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（如多态汉逊酵母（Hansenula polymorphaHansenula polymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕

6、赤酵母表达外源基因最理想。表达外源基因最理想。现在学习的是第5页，共56页提高重组蛋白表达产率的突变宿主提高重组蛋白表达产率的突变宿主能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型：能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型：sscssc1 1sscssc2 2rgrrgr1 1oseose1 1sscssc1111 rhorho-突变类型突变类型生物效应生物效应作用位点作用位点改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的钙离子依赖型的ATPATP酶酶提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达转录后加工转录后加工转录水平转录水平提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达转录水平转录水平提高重组蛋

7、白表达提高重组蛋白表达改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌羧肽酶羧肽酶YY转录水平转录水平提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达现在学习的是第6页，共56页抑制超糖基化作用的突变宿主抑制超糖基化作用的突变宿主能抑制超糖基化的突变类型能抑制超糖基化的突变类型mnnmnnalgalgochoch突变类型突变类型生物效应生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心糖基核心和和外侧糖链外侧糖链两部分两部分组成。组成。酵母菌普遍拥有蛋白酵母菌普遍拥有

8、蛋白质的糖基化系统，但野生质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。基化缺陷株非常重要。甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型现在学习的是第7页，共56页减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体蛋白酶体LysLysHOOCUbiquitin 76 aaUbiquitin 76 aa ubi

9、quitin ligase E3ubiquitin ligase E3 LysLysubiquitin ligase E3ubiquitin ligase E3 LysLys靶蛋白靶蛋白靶蛋白现在学习的是第8页，共56页减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI UBI 1 1 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252（CEP52CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 2 2 编码

10、泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252（CEP52CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 3 3 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白7676（CEP76CEP76）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 4 4 编码泛素五聚体编码泛素五聚体 对数生长期关闭对数生长期关闭 稳定期表达稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC UBC 11、UBC UBC 22、UBC UBC 33、UBC UBC 44、UBC UBC 55、UBC UBC 66、UBC UBC 77现在学习的是第9

11、页，共56页减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI UBI 4 4基因表达，基因表达，UBI UBI 4 4-突变株能突变株能UBI UBI 4 4缺陷型：缺陷型：正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此因此UBI UBI 4 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。UBA UBA 1 1缺陷型：缺陷型：UBAUBA1 1编码泛素激活酶编码泛素激活

12、酶E1E1，UBAUBA1 1突变株是致死性的，但其等位突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。Ubc4 Ubc4-ubc5 ubc5 双突变型：双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。现在学习的是第10页，共56页C 酵母的载体系统6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建酵母中的野生型质粒酵母中的野生型质粒现在学习的是第11页，共56页酵母中的野生型质粒酵母中的野生型质粒

13、酿酒酵母中的酿酒酵母中的2 2m m环状质粒环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有几乎所有的酿酒酵母中都含有22mm双链双链同源重组同源重组REP1REP1RAFRAFSTBSTBorioriREP2REP2FLPFLPIRIRIRIRAABB环状质粒，拷贝数达环状质粒，拷贝数达5050至至100100个。个。IRs IRs 反向重复序列，反向重复序列，600 600 bpbp，重组重组FLPFLP 编码产物驱动编码产物驱动IRsIRs的同源重组的同源重组REPREP 编码产物控制质粒的稳定性编码产物控制质粒的稳定性STBSTB REPREP的结合位点的结合位点接合酵母属中的接合酵母属中的pSR1

14、pSR1和和pSB1pSB1，以及以及克鲁维酵母属中的克鲁维酵母属中的pKD1pKD1等均与等均与22mm质质粒类似。粒类似。现在学习的是第12页，共56页酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建含有含有ARSARS的的YRpYRp质粒的构建质粒的构建 ARSARS为酵母菌中的自主复制序列，为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.50.8-1.5kbkb，染色体上每染色体上每30-4030-40kbkb就 有 一 个就 有 一 个ARSARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒记基因、提供克隆位

15、点的大肠杆菌质粒DNADNA。以以ARSARS为复制子的质粒称为为复制子的质粒称为YRpYRp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200200个，但培养几代个，但培养几代 以以2 2m m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEpYEp后，质粒的丢失率高达后，质粒的丢失率高达50%-70%50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。，主要是由于分配不均匀所致。现在学习的是第13页，共56页酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建含有含有CENCEN的的YCpYCp质粒的构建质粒的构建 CENCEN为酵母菌染色体为酵

16、母菌染色体DNADNA上与染色体均匀分配有关的序列上与染色体均匀分配有关的序列 将将CEN CEN DNADNA插入含插入含ARSARS的质粒中，获得的新载体称为的质粒中，获得的新载体称为YCpYCp YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-51-5个个含有含有TELTEL的的YACYAC质粒的构建质粒的构建现在学习的是第14页，共56页酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建含有酵母菌染色体含有酵母菌染色体DNADNA同源序列的同源序列的YIpYIp质粒的构建质粒的构建 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体在大肠杆菌质粒上组装酵母

17、菌染色体DNADNA特定序列和标记基因，构特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为建出来的质粒称为YipYip。目的基因表达盒通常插在染色体目的基因表达盒通常插在染色体DNADNA特定序列特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNADNA区域。区域。现在学习的是第15页，共56页D 酵母的转化系统6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因现在学习的是第16页，共56页酵母的转化程序酵母的转化

18、程序酵母原生质体转化法酵母原生质体转化法 早 期 酵 母 菌 的 转 化 都 采 用 在 等 渗 缓 冲 液 中 稳 定 的 原 生 质 体 转 化 法早 期 酵 母 菌 的 转 化 都 采 用 在 等 渗 缓 冲 液 中 稳 定 的 原 生 质 体 转 化 法在在C aC a2+2+和和PEGPEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%1-2%。但 该 程。但 该 程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。原 生 质 体 转 化 法 的 一 个 显 著 特 点 是，一 个 受 体 细

19、 胞 可 同 时 接 纳 多原 生 质 体 转 化 法 的 一 个 显 著 特 点 是，一 个 受 体 细 胞 可 同 时 接 纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%25-33%。现在学习的是第17页，共56页酵母的转化程序酵母的转化程序碱金属离子介导的酵母完整细胞的转化碱金属离子介导的酵母完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如LiLi+等）、等）、PEGPEG、热 休 克 处热 休 克 处理后，也可高效吸收质粒理后，也可高效吸收质粒DNADNA，而且具有下列特性：而且

20、具有下列特性：吸收线型吸收线型DNADNA的能力明显大于环状的能力明显大于环状DNADNA，两者相差两者相差8080倍倍共转化现象极为罕见共转化现象极为罕见现在学习的是第18页，共56页酵母的转化程序酵母的转化程序酵母电击转化法酵母电击转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNADNA，但但在此过程中应避免使用在此过程中应避免使用PEGPEG，它对受电击的细胞具有较很大的负作用它对受电击的细胞具有较很大的负作用电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围

21、广，而且转化率可高达广，而且转化率可高达10105 5/m mg DNAg DNA。现在学习的是第19页，共56页转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运单双链单双链DNADNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-3010-30倍；倍；含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制；含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制；不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体这对于体内定点突变酵母基因组极为有利；这对于体内定点突变酵母基因组极为有利；克

22、隆在克隆在YIpYIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体DNADNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%50-80%。现在学习的是第20页，共56页用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有有营养缺陷型营养缺陷型互补基因和互补基因和显性基因显性基因两大类：两大类：营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LE

23、ULEU、TRPTRP、HISHIS、LYSLYS、URAURA、ADEADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因现在学习的是第21页，共56页用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 显性标记基因显性标记基因 显性标记基因的编码产物大都是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因的编码产物大都是毒性物质的抗性蛋白 aph aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶 抗抗G418G418 cat cat 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素抗氯霉素 dhfr dhfr 二氢叶酸还原酶二氢叶

24、酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物 耐受铜离子耐受铜离子 suc2 suc2 蔗糖转化酶蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 ilv2 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型现在学习的是第22页，共56页E 酵母的表达系统6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因在酵母菌中表达的限制因素酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择现在学习的是第23页，共56页酵母启动子的可控

25、性酵母启动子的可控性 温度控制型启动子温度控制型启动子a a-a a a a 型启动子：型启动子：酿酒酵母有酿酒酵母有aa和和a aa a两种单倍体，两种单倍体，分别由分别由M A TM A Taa和和M A TM A Ta aa aa a 型启动子型启动子hmlhmla aa a2-102 2-102 MATaMATaa1a1Sir3-8Sir3-8TSTS 型启动子型启动子 受体细胞基因组受体细胞基因组 重组质粒重组质粒a a 型启动子型启动子hmlhmla aa a2-102 2-102 MATaMATaa1a1Sir3-8Sir3-8TSTS 型启动子型启动子a aa a22a aa

26、a1125253535两个等位基因决定。两个等位基因决定。a aa a11因子决定因子决定a aa a细胞特征表达细胞特征表达a aa a22因因子阻遏子阻遏aa细胞细胞特征表达特征表达a1-a2a1-a2阻遏阻遏a aa a细胞特征表达细胞特征表达编 码编 码a aa a22因 子 的 基 因 突 变 型因 子 的 基 因 突 变 型hmlhmla aa a2-1022-102能产生能产生a aa a22变体，它变体，它能 灭 活能 灭 活a 1a 1，同 时 阻 遏同 时 阻 遏aa型型现在学习的是第24页，共56页酵母启动子的可控性酵母启动子的可控性酿 酒 酵 母酿 酒 酵 母超诱导型启

27、动子超诱导型启动子GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80半乳糖诱导时，半乳糖诱导时，GAL4GAL4高效表达，高效表达，GAL1GAL1、GAL1GAL1、GAL10GAL10超高效表达超高效表达GAL10GAL10PromoterPromoter的 半 乳 糖的 半 乳 糖利 用 酶 系利 用 酶 系由由G A L 1G A L 1 G A L 7G A L

28、 7和和 G A L 1 0G A L 1 0基 因 编 码基 因 编 码现在学习的是第25页，共56页外源基因在酵母中表达的限制因素外源基因在酵母中表达的限制因素外源基因稳态外源基因稳态mRNAmRNA的浓度的浓度外源基因外源基因mRNAmRNA的翻译活性的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性酵母菌对密码子的偏爱性在 酿 酒 酵 母 中，高 丰 度 的 蛋 白 质（如 甘 油 醛在 酿 酒 酵 母 中，高 丰 度 的 蛋 白 质（如 甘 油 醛-3-3-磷 酸 脱 氢 酶磷 酸 脱 氢 酶GAPDHGAPDH、磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶PKGPKG、乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶ADHADH）中中96%96%

29、以上的氨基酸是由以上的氨基酸是由2525个密码子编码的。个密码子编码的。现在学习的是第26页，共56页酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛醛-3-3-磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因GAPDHGAPDH、磷酸甘油激酶基因磷酸甘油激酶基因PKGPKG、乙醇脱氢乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统酶基因酶基因ADHADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化超糖基化能

30、力，往往使得能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。现在学习的是第27页，共56页酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1pKD1已被广泛用作重组异源已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传能稳

31、定遗传4040代以上。代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。于酿酒酵母表达系统。现在学习的是第28页，共56页酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择 巴斯德毕赤酵母是一种巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌甲基营养菌，能在低廉的含甲醇培养基中生，能在低廉的含甲醇培养基中生巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母表达系统长，长，甲醇甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因速、乙醇氧化酶基因AOXAOX1 1所属强启动子、表

32、达的可诱导性是巴斯德毕所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。但甲醇赤酵母表达系统的三大优势。但甲醇易挥发易挥发，操作条件差。，操作条件差。由 于 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 没 有 合 适 的 自 主 复 制 型 载 体，所 以 外 源 基 因 的由 于 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 没 有 合 适 的 自 主 复 制 型 载 体，所 以 外 源 基 因 的表达序列一般表达序列一般整 合整 合入受体的染色体入受体的染色体DNADNA上。在此情况下，外源基因的上。在此情况下，外源基因的有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤

33、酵母系统中获得成功表达。高效表达在很大程度上取决于整合高效表达在很大程度上取决于整合拷 贝 数拷 贝 数的多寡。目前已有的多寡。目前已有5050余 种 具余 种 具现在学习的是第29页，共56页酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择 多型汉逊酵母也是一种多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌甲基营养菌。其自主复制序列。其自主复制序列HARSHARS已被克已被克多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母表达系统隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不

34、同的是，HARSHARS质 粒质 粒能 高 频能 高 频自发地整合在受体的染色体自发地整合在受体的染色体DNADNA上，甚至可以连续整合上，甚至可以连续整合100100多个拷贝，多个拷贝，目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。成功表达。成功表达。现在学习的是第30页，共56页F 利用重组酵母生产乙肝疫苗6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达 由由乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（HBVHBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一

35、种严重感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有的传染病，每年约有200200万万病人死亡，并有病人死亡，并有3 3亿亿人成为人成为HBVHBV携带者，其携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还 没 有 一 种 有 效 的 治 疗 药 物，因 此 高 纯 度 乙 型 疫 苗 的 生 产 对 预 防 病 毒还 没 有 一 种 有 效 的 治 疗 药 物，因 此 高 纯 度 乙 型 疫 苗 的 生 产 对 预 防 病 毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其感染具有重大的社会

36、效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。广泛应用提供了可靠的保证。现在学习的是第31页，共56页乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒乙肝病毒是一种蛋白包裹型的是一种蛋白包裹型的双 链双 链DNADNA病 毒病 毒，具有感染力的病毒颗，具有感染力的病毒颗乙型肝炎病毒的结构乙型肝炎病毒的结构粒呈球面状，直径为粒呈球面状，直径为42 42 n mn m，基 因 组 仅 为基 因 组 仅 为3.2 3.2 kbkb。病毒颗粒的主要结构病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的蛋白是病毒的表面抗原多肽表面抗原多肽（HBsAgHBsAg）或）或S S多 肽多 肽，它具

37、有糖基化和非糖，它具有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核 心 抗 原核 心 抗 原（HBcAgHBcAg）、病 毒）、病 毒DNADNA 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的2222聚合酶、微量病毒蛋白。聚合酶、微量病毒蛋白。nmnm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的10001000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S S、MM、L L多肽。多肽。现在学习的是第32页，

38、共56页乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因ATGATGATGATGATGATGTAATAA108 aa108 aa55 aa55 aa226 aa226 aapreS1preS1preS2preS2SSS S 多肽多肽226 aa226 aaM M 多肽多肽281 aa281 aaL L 多肽多肽399 aa399 aa现在学习的是第33页，共56页乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫传统乙肝疫苗

39、的制备传统乙肝疫苗的制备苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。现在学习的是第34页，共56页产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20 20世纪世纪8080年代开始选择年代开始选择酿酒酵母酿酒酵母表达重组表达重组HBsAgHBsAg，主要工作包括主要工作包括将将S S多肽的编码置于多肽的编码置于ADH1ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活启动子控制下，转化子能表达出

40、具有免疫活性 的 重 组 蛋 白，它 在 细 胞 提 取 物 中 以 球 形 脂 蛋 白 颗 粒 的 形 式 存 在，平性 的 重 组 蛋 白，它 在 细 胞 提 取 物 中 以 球 形 脂 蛋 白 颗 粒 的 形 式 存 在，平均 颗 粒 直 径 为均 颗 粒 直 径 为2 22 2n mn m，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。的病毒颗粒相同。目前，由酿酒酵母生产的重组目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAgHBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化颗粒已作为乙肝疫苗商品化重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的重组产物的最终产量可达细胞总蛋白

41、量的1%-2%1%-2%。进一步的研究表明，进一步的研究表明，MM多肽和多肽和L L多肽对多肽对S S型疫苗具有显著的增效作型疫苗具有显著的增效作用，由 三 者（或 两 者）构 成 的 复 合 型 乙 肝 疫 苗 还 可 以 诱 导 那 些 对用，由 三 者（或 两 者）构 成 的 复 合 型 乙 肝 疫 苗 还 可 以 诱 导 那 些 对S S抗抗原缺乏响应的人群的免疫反应。原缺乏响应的人群的免疫反应。现在学习的是第35页，共56页产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建PARS2PARS2Bgl IIB

42、gl II5 AOX15 AOX1HBsAgHBsAgPHIS4PHIS43 AOX13 AOX1Bgl IIBgl IIpBSAG151pBSAG15111 kb11 kbBgl IIBgl II5 AOX15 AOX1HBsAgHBsAgPHIS4PHIS43 AOX13 AOX1hishis+的转化子的转化子重组分子重组分子转化转化hishis-的受体细胞的受体细胞染色体染色体DNADNA现在学习的是第36页，共56页产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母重组巴斯德毕赤酵母的性能重组巴斯德毕赤酵母的性能 由 于 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 染 色 体由 于

43、巴 斯 德 毕 赤 酵 母 染 色 体D N AD N A上 还 拥 有 第 二 个 乙 醇 氧 化 酶 基 因上 还 拥 有 第 二 个 乙 醇 氧 化 酶 基 因AOX2AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲醇 诱 导醇 诱 导HBsAgHBsAg表达，最终表达，最终S S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%3%在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个在大规模的生产过程中，

44、巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240240L L的 发 酵 罐的 发 酵 罐中培养，最终可获得中培养，最终可获得9090克克2222nmnm的的HBsAgHBsAg颗粒，足够制成颗粒，足够制成900900万份乙肝万份乙肝疫苗。疫苗。现在学习的是第37页，共56页G 酵母糖蛋白生产的人源化改造6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达 除抗体外，哺乳动物绝大多数糖蛋白的半衰期和功能依赖于糖链末端的除抗体外，哺乳动物绝大多数糖蛋白的半衰期和功能依赖于糖链末端的唾唾液酸液酸，其它裸露的末端糖（如甘露糖、，其它裸露的末端糖（如甘露糖、N-N-乙酰葡糖胺、半乳糖等）会被糖特异性乙酰葡糖胺、半乳糖等

45、）会被糖特异性的受体或凝集素清除。由于不少药用糖蛋白需要唾液酸化，因此其生产目前只能依靠的受体或凝集素清除。由于不少药用糖蛋白需要唾液酸化，因此其生产目前只能依靠哺乳动物受体，因为后者能进行人样化的哺乳动物受体，因为后者能进行人样化的N-N-糖基化糖基化反应，包括在末端加唾液酸的反应，包括在末端加唾液酸的能力。酵母和丝状真菌作为重组蛋白表达系统，与哺乳动物细胞相比，具能力。酵母和丝状真菌作为重组蛋白表达系统，与哺乳动物细胞相比，具有较高的重组蛋白表达率、较短的发酵周期、能在化学成分确定的培养基有较高的重组蛋白表达率、较短的发酵周期、能在化学成分确定的培养基中生长等很多优势。然而，野生型酵母往往

46、将高甘露糖型的多糖链加在蛋中生长等很多优势。然而，野生型酵母往往将高甘露糖型的多糖链加在蛋白质上，直接影响表达产白质上，直接影响表达产物在人体内的稳定性与功效。物在人体内的稳定性与功效。现在学习的是第38页，共56页ERERERER两种多糖合成途径的比较两种多糖合成途径的比较人类糖蛋白侧链多聚糖的成熟，涉及下列人类糖蛋白侧链多聚糖的成熟，涉及下列基因编码的酶系：基因编码的酶系：MnsIMnsI：-1,2-1,2-甘露糖苷酶甘露糖苷酶 IIMnsIIMnsII：-1,2-1,2-甘露糖苷酶甘露糖苷酶 IIIIGnTIGnTI：-1,2-1,2-NN-乙酰葡糖胺转移酶乙酰葡糖胺转移酶 IIGnTI

47、IGnTII：-1,2-1,2-NN-乙酰葡糖胺转移酶乙酰葡糖胺转移酶 IIIIGalTGalT：-1,-1,44-半乳糖苷转移酶半乳糖苷转移酶SiaTSiaT：-2,6-2,6-唾液酸苷转移酶唾液酸苷转移酶巴斯德毕赤酵母细胞中不存在上述巴斯德毕赤酵母细胞中不存在上述酶系。酶系。现在学习的是第39页，共56页巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造JC308 WTJC308 WTRDP750RDP750YSH557YSH557YSH597YSH597Y11430 WTY11430 WTYSH551YSH551Stephen R.Hamilton Stephen R.

48、Hamilton et alet al.ScienceScience 313313.1441.2006.1441.2006敲除敲除44个基因，摧毁个基因，摧毁巴斯德毕赤酵母原有的超糖基化系统：巴斯德毕赤酵母原有的超糖基化系统：och1och1，pno1pno1，mnn4Bmnn4B，bmt2bmt2导入导入99个基因，构建个基因，构建人的糖基化系统：人的糖基化系统：UgnTUgnT：小鼠的：小鼠的UDP-UDP-NN-乙酰葡糖胺转运蛋白乙酰葡糖胺转运蛋白 UgnTUgnT：克鲁维酵母的：克鲁维酵母的UDP-UDP-NN-乙酰葡糖胺转运蛋白乙酰葡糖胺转运蛋白 MnsIMnsI：小鼠的：小鼠的-1

49、,2-1,2-甘露糖苷酶甘露糖苷酶 II MnsIIMnsII：果蝇的：果蝇的-1,2-1,2-甘露糖苷酶甘露糖苷酶 IIII GnTIGnTI：人的：人的-1,2-N-1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶乙酰葡糖胺转移酶 II GnTIIGnTII：大鼠的：大鼠的-1,2-N-1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶乙酰葡糖胺转移酶 IIII GalEGalE：裂殖酵母的：裂殖酵母的半乳糖差向异构酶半乳糖差向异构酶 GalEGalE：果蝇的：果蝇的UDP-UDP-半乳糖转运蛋白半乳糖转运蛋白 GalTGalT：人的人的-1,4-1,4-半乳糖苷转移酶半乳糖苷转移酶YSH577YSH577rEPOrEPO现在学习

50、的是第40页，共56页巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造JC308 WTJC308 WTRDP750RDP750YSH557YSH557YSH597YSH597Y11430 WTY11430 WTYSH551YSH551Stephen R.Hamilton Stephen R.Hamilton et alet al.ScienceScience 313313.1441.2006.1441.2006YSH577YSH577rEPOrEPOJC308 WTJC308 WTRDP750RDP750-1,N-GlcNAc-1,N-GlcNAc-1,4-GlcNAc-1