人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案.ppt

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1、人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望提纲病原学简介样品采集与运送实验室检测病原学简介分类培养特性生化特征致病因子链球菌分类伯杰分类6 6大类群，大类群，2929个种个种16SrRNA序列同源性和化学分类链球菌属分类学定义无芽孢革兰氏阳性细菌，细胞形态为球形或球无芽孢革兰氏阳性细菌，细胞形态为球形或球杆状，直径杆状，直径0.50.52.02.0微米，细胞成对或成链排微米，细胞成对或成链排列，有些种具有荚膜。列，

2、有些种具有荚膜。链球菌分类根据溶血现象分类根据溶血现象分类 甲型溶血性链球菌：称甲型溶血或甲型溶血性链球菌：称甲型溶血或 溶血，溶血，溶血溶血环中的红细胞并未完全溶解。多为条件致病菌。环中的红细胞并未完全溶解。多为条件致病菌。乙型溶血性链球菌：称乙型溶血或乙型溶血性链球菌：称乙型溶血或 溶血，溶血，溶血溶血环中的红细胞完全溶解，致病力强环中的红细胞完全溶解，致病力强 丙型链球菌：无溶血环，一般不致病丙型链球菌：无溶血环，一般不致病猪链球菌猪链球菌 溶血溶血(偶而也有弱偶而也有弱 溶血或溶血或 溶血、溶血、溶血现象均不明显溶血现象均不明显)，某些菌株在马血培养，某些菌株在马血培养基上基上 溶血溶

3、血链球菌分类根据抗原结构的分类根据抗原结构的分类 兰氏分类：兰氏分类：按按多糖类抗原（多糖类抗原（C C抗原）将链球菌抗原）将链球菌分成分成A A、B B、C C、D D、E E、F F、G G、H H、K K、L L、MM、N N、O O、P P、Q Q、R R、S S和和T T群群(其中缺其中缺I I、J J群群)，近年又增加，近年又增加U U、V V群，共群，共2020群，每个群有群，每个群有1 1个或多个种。个或多个种。几乎所有群的菌株，都能从病猪体内分离得到，几乎所有群的菌株，都能从病猪体内分离得到，引起猪病并偶尔经伤口感染人的链球菌主要有引起猪病并偶尔经伤口感染人的链球菌主要有 R

4、 R群的群的2 2型猪链球菌型猪链球菌 S S群和群和D D群的群的1 1型猪链球菌型猪链球菌 F F群的咽峡炎链球菌群的咽峡炎链球菌 L L、S S、T T、U U、V V群链球菌等群链球菌等链球菌分类猪链球菌血清2型兰氏分类：兰氏分类：R R群群根据菌体荚膜抗原特性不同，分为根据菌体荚膜抗原特性不同，分为3535个血清个血清型：型：1/21/2，1 13434型型致病性最强的是致病性最强的是2 2型，其次为型，其次为1 1型型2型猪链球菌19541954年英国分离年英国分离19681968年命名为荚膜年命名为荚膜II II型猪链球菌型猪链球菌分为致病力不同的株分为致病力不同的株猪链球菌培养

5、特性革兰氏阳性无芽胞球菌，兼性厌氧营养要求较高，在普通培养基中生长不良，需补充血液、血清、葡萄糖等在血清肉汤中易形成长链，管底呈絮状沉淀在绵羊鲜血琼脂平板上37 培养培养2424小时，形成小时，形成直径l2毫米的细小菌落，灰白色，半透明，边缘整齐，凸起，光滑，溶血（有时呈弱溶血或溶血不明显），48小时后可有草绿色色素沉着。猪链球菌培养特性刚分离的猪链球菌，典型的革兰氏阳性链球菌，链长达二十多个二代培养后细菌形态不典型，结晶紫作色不良，多为不成链球杆菌，少数呈短链状。链球菌链球菌.Gram stain.CDC/Dr.Richard Facklam 链球菌链球菌 猪链球菌培养特性10培养不生长，4

6、5培养生长，6030分钟试验不生长5530分钟即可被杀死 猪链球菌生化特征猪链球菌生化特性往往差异较大，一般难以作为分类依据触酶试验阴性水解七叶苷、淀粉和精氨酸，不水解马尿酸盐和明胶分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露糖，不分解阿拉伯糖、鼠李糖和甘露醇致病因子猪链球菌猪链球菌2 2型主要型主要致病因子致病因子 溶菌酶释放蛋白（溶菌酶释放蛋白（muramidase-released muramidase-released protein,MRPprotein,MRP）细胞外因子（细胞外因子（extracellular factor,EFextracellular factor,EF）猪溶素（猪溶

7、素（suilysinsuilysin）荚荚膜多糖膜多糖用南通地区分离的人源猪链球菌对兔和小白鼠的用南通地区分离的人源猪链球菌对兔和小白鼠的攻击试验表明，猪链可使家兔发病，并引起死亡。攻击试验表明，猪链可使家兔发病，并引起死亡。而小白鼠不敏感而小白鼠不敏感样品采集与运送采样器材样品种类血液和脑脊液标本采集方法样品运输保存注意事项采样器材 无菌封闭性好的试管，最好使用负压采血管或带螺口盖的塑料管，避免使用玻璃试管。可以清楚标记且标记不易脱落的记号笔。可以方便采集组织标本的无菌容器。无菌的剪刀、镊子和手术刀。采样器材 血平皿(或者血培养瓶)。一次性隔离服、乳胶手套、防护口罩等带有冰袋或者冰排的安全可

8、靠的保温运输容器采样送检单样品种类 现症病人不抗凝全血现症病人抗凝血发病47天、1016天不抗凝血脑脊液标本尸体解剖应无菌采集肝、脾、心血、胸（腹）水如有病死猪也可进行解剖，取肝、脾、肾、心血、肉 血液和脑脊液标本采集方法 无菌抽取血液510ml分置于有抗凝剂和无抗凝剂的无菌试管或者负压采血管中按常规方法腰穿采集适量脑脊液标本置于无菌试管中采集标本的同时接种血平皿或者血培养瓶，置于3537培养样品运输保存 所有的原始标本在转运过程中应置于安全可靠容器中。标本应冷藏运输。需要马上检测的标本在实验室可暂放4-8冰箱。剩余标本放置于-70保存。注意事项 严格严格无菌操作无菌操作，防止标本污染。，防止

9、标本污染。用于分离培养的标本应在用于分离培养的标本应在抗菌治疗前采集抗菌治疗前采集。应应尽尽可可能能床床边边接接种种分分离离培培养养，如如无无法法立立即即接接种种，应在样品送达实验室后立即进行分离。应在样品送达实验室后立即进行分离。在标本采集过程中，注意安全防护。使用一次性在标本采集过程中，注意安全防护。使用一次性隔离服、隔离服、乳胶手套乳胶手套、防护口罩、防护口罩采取预防措施，防止针头等采取预防措施，防止针头等锐器刺伤锐器刺伤如发生伤口意外暴露，应及时清洗和消毒，并预如发生伤口意外暴露，应及时清洗和消毒，并预防性服药防性服药实验室检测 猪链球菌检验程序猪链球菌检验程序推片镜检分离鉴定检测要点

10、 猪链球菌检验程序猪链球菌检验程序 病人检样（脑脊液、血液等）病人检样（脑脊液、血液等）增菌培养增菌培养（脑心肉汤（脑心肉汤/牛血清葡萄糖牛血清葡萄糖肉汤肉汤/血培养瓶）血培养瓶）革兰氏染色革兰氏染色 触酶试验触酶试验 推片镜检 猪链球菌检验程序猪链球菌检验程序(续续)羊血琼脂平板羊血琼脂平板羊血琼脂平板羊血琼脂平板 （37373737，5%5%5%5%COCOCOCO2 2 2 2，24h24h24h24h）溶血溶血溶血溶血(偶而也有弱偶而也有弱偶而也有弱偶而也有弱溶血溶血溶血溶血)PCRPCRPCRPCR检测检测检测检测 血清学检测血清学检测血清学检测血清学检测 生化鉴定生化鉴定生化鉴定生

11、化鉴定 推片镜检 抗凝血或脑脊液可推片革兰氏染色镜检阳性标本可见中性粒细胞内吞噬颗粒，偶尔可见革兰阳性球菌感染鼠尾血推片感染兔心脏血推片分离鉴定 血平板直接接种血平板直接接种 新鲜羊血琼脂平板新鲜羊血琼脂平板/含含8%8%新生牛血清的营养琼脂平新生牛血清的营养琼脂平板板 血或脑脊液等标本血或脑脊液等标本 直接接种直接接种 组织标本组织标本 可直接涂抹平板或剪碎用无菌生理盐水洗涤，洗液接种平可直接涂抹平板或剪碎用无菌生理盐水洗涤，洗液接种平板板置置37375%5%COCO2 2培养箱或者烛缸中培养培养箱或者烛缸中培养2424小时小时分离鉴定增菌培养待检标本置约待检标本置约1010倍体积脑心肉汤倍

12、体积脑心肉汤/含含8%8%新生牛新生牛血清葡萄糖肉汤（附配方血清葡萄糖肉汤（附配方）/商品化血培养瓶中商品化血培养瓶中增菌培养增菌培养37 37 2424小时小时增菌培养物接种新鲜羊血琼脂平板，置增菌培养物接种新鲜羊血琼脂平板，置37375%5%CO2CO2培养箱或者烛缸中培养培养箱或者烛缸中培养2424小时小时如果是如果是污染标本污染标本,则要接种于选择增菌培养液则要接种于选择增菌培养液（含（含1515微克微克/毫升多粘菌素毫升多粘菌素B B，3030微克微克/毫升萘毫升萘啶酮酸的脑心培养基）进行增菌啶酮酸的脑心培养基）进行增菌 附：葡萄糖肉汤（含8%新生牛血清）成分：成分：酵母浸膏酵母浸膏

13、 3 3克克10%10%葡萄糖溶液葡萄糖溶液 20 20毫升毫升枸椽酸钠枸椽酸钠 3 3克克磷酸氢二钾磷酸氢二钾 2 2克克牛肉汤牛肉汤 900 900毫升毫升24.7%24.7%硫酸镁硫酸镁 20 20毫升毫升 0.5%0.5%对氨苯甲酸对氨苯甲酸 5 5毫升毫升新生牛血清新生牛血清 80 80毫升毫升 附：葡萄糖肉汤（含8%新生牛血清）制法制法除除葡葡萄萄糖糖及及硫硫酸酸镁镁外外,其其他他各各物物混混合合,加加热热溶溶解解,矫正矫正pHpH至至7.6,7.6,再煮沸再煮沸5 5分钟分钟用用滤滤纸纸过过滤滤并并分分装装于于100100毫毫升升三三角角烧烧瓶瓶内内,每每瓶瓶5050毫升毫升,包

14、扎瓶口包扎瓶口,高压灭菌高压灭菌1010磅磅2020分钟分钟将将葡葡萄萄糖糖配配成成10%10%水水溶溶液液,硫硫酸酸镁镁配配成成24.7%24.7%水水溶液溶液,分别高压灭菌分别高压灭菌8 8磅磅1515分钟分钟每每5050毫升无菌肉汤内加入无菌葡萄糖及磷酸镁毫升无菌肉汤内加入无菌葡萄糖及磷酸镁水溶液各水溶液各1 1毫升毫升,混匀混匀.于于3737培养培养2 2天证明无细天证明无细菌生长后存于冰箱内备用。菌生长后存于冰箱内备用。分离鉴定形态学鉴定形态学鉴定 挑取平板上可疑菌落革兰氏染色镜检挑取平板上可疑菌落革兰氏染色镜检 筛检生化试验筛检生化试验 猪链球菌触酶试验阴性，可与葡萄球菌区别猪链球

15、菌触酶试验阴性，可与葡萄球菌区别 血清学检测血清学检测 标准分型诊断血清，标准分型诊断血清，进行进行乳胶凝集试验或玻片凝集试验乳胶凝集试验或玻片凝集试验 确定所分离的菌株为确定所分离的菌株为R R群，与群，与2 2型猪链球菌分型血清反应型猪链球菌分型血清反应 目前目前国内无分型诊断血清供应国内无分型诊断血清供应。据报道。据报道,加拿大和澳大利加拿大和澳大利亚有商品化血清分型试剂。亚有商品化血清分型试剂。分离鉴定生化鉴定 血平板上挑选可疑菌落进行革兰氏染色和触酶血平板上挑选可疑菌落进行革兰氏染色和触酶试验试验符合链球菌特征，接种血平板纯培养后进行生符合链球菌特征，接种血平板纯培养后进行生化鉴定化

16、鉴定 梅里埃梅里埃APIAPI生化鉴定系统生化鉴定系统API 20 strepAPI 20 strep可鉴定可鉴定2 2型猪链球菌，推荐使用（鉴定程序详见操作说型猪链球菌，推荐使用（鉴定程序详见操作说明）明）分离鉴定PCR检测猪链球菌种特异性基因猪链球菌种特异性基因1616S rDNAS rDNA猪链球菌猪链球菌2 2型和型和1/21/2型型特异的荚膜多糖基型型特异的荚膜多糖基因因cps2A cps2A 毒力因子溶菌酶释放蛋白基因毒力因子溶菌酶释放蛋白基因MRP MRP 细胞外蛋白因子基因细胞外蛋白因子基因EF EF 基因鉴定，使用基因鉴定，使用基因鉴定，使用基因鉴定，使用PCRPCRPCRP

17、CR技术和对技术和对技术和对技术和对PCRPCRPCRPCR产物进行序列分析产物进行序列分析产物进行序列分析产物进行序列分析 检测猪链球菌检测猪链球菌种特异性种特异性1616S rRNAS rRNA。上游引物：上游引物：cagtatttaccgcatggtagatatcagtatttaccgcatggtagatat 下游引物：下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaagtaagataccgtcaagtgagaa检测猪链球菌荚膜多糖基因（cps2A）上游引物：上游引物：gttgagtccttatacacctgttgttgagtccttatacacctgtt 下游引物：下游引物：cag

18、aaaattcatattgtccacccagaaaattcatattgtccacc检测溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段（mrp）上游引物：上游引物：ggtatacctt gctggtaccg ttcggtatacctt gctggtaccg ttc 下游引物：下游引物：agtctctaca gctgtagctg gagtctctaca gctgtagctg g PCR PCR反应的条件：反应的条件：94 94预变性预变性5 5分钟分钟;94;94、3030秒，秒，6060、3030秒，秒，7272、3030秒，秒，2525个循环，最后延伸个循环，最后延伸7272、5 5分钟。分钟。取取5 5微升

19、扩增产物在微升扩增产物在1.21.2的琼脂糖凝胶中进行电的琼脂糖凝胶中进行电泳。泳。Multiplex PCR Assay for Detection of Multiplex PCR Assay for Detection of Streptococcus Streptococcus suis suis Species and Serotypes 2 and 1/2 in Tonsils of Species and Serotypes 2 and 1/2 in Tonsils of Live and Dead Pigs.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Li

20、ve and Dead Pigs.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,July 2004,p.31693175July 2004,p.31693175 Primer Primer Sequence(5-3)Sequence(5-3)size size(bp)(bp)1616S-195(s)S-195(s)CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT 2942941616S-489(as2)S-489(as2)GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA cps2J-

21、scps2J-sGTTGAGTCCTTATACACCTGTTGTTGAGTCCTTATACACCTGTT459459cps2J-ascps2J-asCAGAAAATTCATATTGTCCACC CAGAAAATTCATATTGTCCACC CI 6-s CI 6-s GTTGAGTCCTTATACACCTGTTACTCAGTGCCGCAGCTGTTGAGTCCTTATACACCTGTTACTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAACGCATT 620620CI 7-as CI 7-as CAGAAAATTCATATTGTCCACCCGACTTCACCCCAATCCAGAAAATTCATA

22、TTGTCCACCCGACTTCACCCCAATCATCTATCC ATCTATCC Multiplex PCR Assays for Simultaneous Detection of Six Multiplex PCR Assays for Simultaneous Detection of Six Major Serotypes and Two Virulence-Associated Major Serotypes and Two Virulence-Associated Phenotypes of Phenotypes of Streptococcus suis Streptococ

23、cus suis in Tonsillar Specimens in Tonsillar Specimens from Pigs.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Aug.from Pigs.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Aug.2002,p.292229292002,p.29222929The cps Genes of Streptococcus suis Serotypes 1,2,and The cps Genes of Streptococcus suis Serotypes 1,2,and 9:Development

24、 of Rapid Serotype-Specific PCR Assays.9:Development of Rapid Serotype-Specific PCR Assays.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Oct.1999,JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Oct.1999,p.31463152p.31463152Use of Ribotyping and Hemolysin Activity To Identify Use of Ribotyping and Hemolysin Activity To Identify

25、 Highly Virulent Highly Virulent Streptococcus suis Streptococcus suis Type 2 Isolates.Type 2 Isolates.JOURNAL OF CLINICA MICROBIOLOGY,Jan.1998,p.1519JOURNAL OF CLINICA MICROBIOLOGY,Jan.1998,p.1519 检测要点传代培养后细菌形态不典型,多为革兰氏阴性球杆菌,不成链,因此刚分离到的细菌形态观察十分重要链球菌的生化特性变化较大，链球菌属内的各种链球菌的生化相近，因此，按照伯杰氏细菌鉴定手册难以对菌株进行菌种鉴定检测要点由于猪链球菌是新近发现的菌种，一些微生物自动鉴定系统没有该菌种的相关数据。98年用MAS-300微生物自动生化分析仪，曾将2型猪链球菌误判为血链球菌用API 20 strep生化系统能很好地对分离株进行菌种鉴定PCR也是有效和快速的检测方法谢谢！