基因工程之DNA重组技术的基本工具.pptx

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1、基因工程之DNA重组技术的基本工具 课程标准中有关现代生物科技专题的核心知识的要求课程标准中有关现代生物科技专题的核心知识的要求课程标准中有关现代生物科技专题的核心知识的要求课程标准中有关现代生物科技专题的核心知识的要求 细胞工程 本模块知识内容的构建顺序：本模块知识内容的构建顺序：基因工程基因工程基因工程基因工程 细胞工程细胞工程细胞工程细胞工程 胚胎工程胚胎工程胚胎工程胚胎工程 生态工程生态工程生态工程生态工程 分子水平分子水平分子水平分子水平细胞水平细胞水平细胞水平细胞水平个体水平个体水平个体水平个体水平群体水平群体水平群体水平群体水平微观微观宏观宏观中观中观专题一专题一基因工程基因工程

2、科技探索之路科技探索之路 1944 1944年，年，年，年，艾弗里艾弗里艾弗里艾弗里证明证明证明证明DNADNA是遗传物质，是遗传物质，是遗传物质，是遗传物质，DNADNA可从可从可从可从一种生物个体转移到另一种生物个体。一种生物个体转移到另一种生物个体。一种生物个体转移到另一种生物个体。一种生物个体转移到另一种生物个体。科技探索之路科技探索之路 1953年，年，沃森、克里克沃森、克里克提出提出DNA的的双螺旋结双螺旋结构构模型。模型。科技探索之路科技探索之路克里克克里克等提出等提出中心法则中心法则DNADNARNARNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译逆转录逆转录逆转

3、录逆转录复制复制复制复制科技探索之路科技探索之路 1963196319631963年年年年尼伦伯格和马太尼伦伯格和马太尼伦伯格和马太尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的遗传密遗传密遗传密遗传密码码码码，19661966年年年年霍拉纳霍拉纳霍拉纳霍拉纳用实验加以证明。用实验加以证明。用实验加以证明。用实验加以证明。基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程 基因工程，又叫基因工程，又叫DNA重组技术重组技术。通俗。通俗的说，就是的说，就是按照人们的意愿按照人们的意愿，把，把一种生物一种生物的的某种基因某种基因提取出来，加以修饰改造，

4、然提取出来，加以修饰改造，然后放到后放到另一种生物的细胞里另一种生物的细胞里，定向地改造，定向地改造生物的遗传特性。生物的遗传特性。基因工程的概念基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达每每100kg 100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取猪或牛的胰腺中仅可提取4 4到到5g5g。1979年，美国将人的年，美国将人的胰岛素基因胰岛素基因重组到重组

5、到大肠杆菌大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药治疗糖尿病特效药 据据WTOWTO调查：调查：2005 2005年全世界约有糖尿病患者年全世界约有糖尿病患者1.81.8亿人，亿人，我国约我国约60006000万。万。胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素思考思考思考思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状：转基因技术实现了一种生物的某些性状：转基因技术实现了一种生物的某些性状：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学在另一种生物中表达。这些性状的表达与我

6、们学在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？过的基因的什么过程有关？过的基因的什么过程有关？过的基因的什么过程有关？DNA(DNA(基因基因基因基因)mRNAmRNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质(性状性状性状性状)转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译某种药物蛋白的基因某种药物蛋白的基因烟草的烟草的DNA如何实现药物基因在烟草中的表达，提前要做哪些工作？如何实现药物基因在烟草中的表达，提前要做哪些工作？准确切割准确切割DNADNA的工具（的工具（“分子手术刀分子手术刀”）限制性内切酶限制性内切酶DNADNA片段的连接工具（片段的连接工具（“分子缝合针分子缝合针”）DNADNA连

7、接酶连接酶基因转移工具（基因转移工具（“分子运输车分子运输车”）运载体运载体 DNA DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具学习目标1、明确基因工程的原理。、明确基因工程的原理。2、举例说明基因工程的操作工具、种类和作用。、举例说明基因工程的操作工具、种类和作用。3、运用所学的、运用所学的DNA重组技术，模拟制作重组重组技术，模拟制作重组DNA分子模型。分子模型。自然界是否存在一种生物的自然界是否存在一种生物的DNADNA进入另一生物的情况？进入另一生物的情况？2.2.单细胞生物并没有在进化中灭绝，有何保护机制？单细胞生物并没有在进化中灭绝，有何保护机制？可能产生了一些特殊的酶来可能产生了

8、一些特殊的酶来防范。可而这种酶能识别防范。可而这种酶能识别外来侵外来侵入的入的DNA并将其分解，而对并将其分解，而对自自身的身的DNA不能起作用。不能起作用。“分子手术刀分子手术刀”限限制性核酸内切酶制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：主要来源：2.种类与命名：种类与命名：主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化现在已经从约现在已经从约300300种微生物中分离出了约种微生物中分离出了约40004000种限制性种限制性内切酶内切酶(限制酶限制酶)。例如：流感嗜血杆菌的例如：流感嗜血杆菌的d d菌株菌株(Hae

9、mophilus influenzae d)Haemophilus influenzae d)中先后分离到中先后分离到3 3种限制酶，则分种限制酶，则分别命名为别命名为:Hind、Hind和和Hind限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：主要来源：2.种类与命名：种类与命名：3.功能（特异性）功能（特异性）识别双链识别双链DNA分子中分子中特定特定核苷酸序列，并且核苷酸序列，并且使每条链中使每条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的磷酸的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化 T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A限制性核酸内

10、切酶“分子手术刀”1.主要来源：主要来源：2.种类与命名：种类与命名：3.功能（特异性）功能（特异性）4.限制酶识别序列限制酶识别序列识别双链识别双链DNA分子中分子中特定特定核苷酸序列，并且核苷酸序列，并且使每条链中使每条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的磷酸的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化 大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由6 6个核苷酸组成，个核苷酸组成，少数的识别序列由少数的识别序列由4 4、5 5或或8 8个核苷酸组成个核苷酸组成限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：

11、主要来源：2.种类与命名：种类与命名：3.功能（特异性）功能（特异性）4.限制酶识别序列限制酶识别序列5.作用结果：作用结果：识别双链识别双链DNA分子中分子中特定特定核苷酸序列，并且核苷酸序列，并且使每条链中使每条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的磷酸的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端 大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由6 6个核苷酸组成，个核苷酸组成，少数的识别序列由少数的识别序列由4 4、5 5或或8 8个核苷酸组成个核苷酸组成 被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两

12、条单链的切口，带有两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫样的切口叫黏性末端黏性末端。EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端Sma平末端平末端平末端平末端GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGEcoREcoRG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G GG G G GAATTCAATTCAATTCAATTC

13、CTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G不同来源的不同来源的不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段连接起来片段连接起来片段连接起来片段连接起来生物生物生物生物A A基因片段基因片段基因片段基因片段生物生物生物生物B B基因片段基因片段基因片段基因片段G G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G GG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G酶切酶切酶切酶切“分子

14、缝合针”DNA连接酶 DNA连接酶连接酶可把黏性末端之间的缝隙可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，起来，把切下来的把切下来的DNA片段拼接成新片段拼接成新的的DNA，即将，即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来.可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，EcoliDNAEcoliDNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，

15、但效率较低起来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶比较几种酶的作用比较几种酶的作用断开的化学键断开的化学键结果结果限制性内切酶限制性内切酶DNA酶酶DNA解旋酶解旋酶特定位置的特定位置的磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对碱基对之间的氢键之间的氢键脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNA片段片段特定末端特定末端DNA单链单链全部的磷酸全部的磷酸二酯键二酯键DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶连接连接DNADNA链链双链双链单链单链连接部位连接部位在两在两DNADNA片片段之间形成段之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键将单个核苷酸加到已将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的末存在的核酸片段的末端

16、上，形成端上，形成磷酸二酯磷酸二酯键键模板模板不需要不需要需要需要DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是同一物质吗聚合酶是同一物质吗?聚焦二：聚焦二：“分子缝合针分子缝合针”-DNA连接连接酶酶DNADNA复制复制要让一个从甲生物细胞内取出来的要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是外源基因送入细胞的工具就是运载体运载体。基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”运载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞

17、无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选常用运载体：细菌的质粒 噬菌体的衍生物或某些动植物病毒假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？常用的载体：质粒常用的载体：质粒能复制并带着能复制并带着能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制因一起复制因一起复制有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在

18、，可用含存在，可用含存在，可用含氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（分子手术刀（分子手术刀)识别双链识别双链DNADNA分子中分子中特定特定核苷酸序列，并且使每条核苷酸序列，并且使每条链中链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端功能功能来源来源结果结果DNADNA连接酶连接酶（分子缝合线（分子缝合线)基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体（分子运输车载体（分子运输车)功能功

19、能种类种类种类种类条件条件对受体细胞无害。对受体细胞无害。EcoliEcoli连接酶连接酶将切下来的将切下来的DNADNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNADNA片段。片段。T T4 4 DNADNA连接酶连接酶能在受体细胞中稳定保存并大量复制。能在受体细胞中稳定保存并大量复制。有一个至多个限制酶切割位点。有一个至多个限制酶切割位点。有特殊的遗传标记基因，便于筛选。有特殊的遗传标记基因，便于筛选。质粒、动植物病毒和质粒、动植物病毒和噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物。总结课下制作：课下制作：使用使用EcoRI酶、酶、E.coliDNA连接酶连接酶形成的形成的DNA重组的重组的模型模型，下节课展示。，

20、下节课展示。CTGCAG(1)GCCGGCTTAAGACGTCGCCGGTCAAATTCG(2)(3)(5)(6)(7)(8)CTGCAGGACGTC(1)(5)GTCAACTGACTGGTCA(2)(7)GCCGGCCG(6)(3)（4）GCTTAAAATTCG(8)可缝合两片断，可缝合两片断，上下左右颠倒颠上下左右颠倒颠v1、关于限制酶的说法中，正确的是（、关于限制酶的说法中，正确的是（）vA限制酶是一种酶，只识别限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序碱基序列列vBEcoRI切割的是切割的是GA之间的氢键之间的氢键vC限制酶一般不切割自身的限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切分子，只切

21、割外源割外源DNAvD限制酶只存在于原核生物中限制酶只存在于原核生物中练习练习2、DNA连接酶催化的反应是连接酶催化的反应是()vADNA复制时母链与子链之间形成氢键复制时母链与子链之间形成氢键B黏性末端碱基之间形成氢键黏性末端碱基之间形成氢键vC两个两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接片段黏性末端之间的缝隙的连接vDA、B、C都不正确都不正确3.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的的DNA片段，需使用（片段，需使用（）vA.同种限制酶同种限制酶B.两种限制酶两种限制酶vC.同种连接酶同种连接酶D.两种连接酶两种连接酶Ac3、作为基因的运输工具、作为

22、基因的运输工具载体，必须具备的载体，必须具备的条件及理由是条件及理由是()vA能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因量复制，以便提供大量的目的基因vB具有多个限制酶切点，以便于目的基因具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达的表达vC具有某些标记基因，以便为目的基因的具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件表达提供条件vD能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选便于进行筛选A4.4.基因工程常用的受体细胞有（基因工程常用的受体细胞有（）（1 1）大肠杆菌）大肠杆菌 （2 2）枯草杆菌）枯草杆菌（3 3）支原体）支原体 （4 4）动植物细胞）动植物细胞A.A.（3 3）（）（4 4）B.B.（1 1）（）（2 2）（）（4 4）C.C.（2 2）（）（3 3）（）（4 4）D.D.（1 1）（）（2 2）（）（3 3）B5 5、在受体细胞中能检测出目的基因是因为、在受体细胞中能检测出目的基因是因为()()A A目的基因上有标记目的基因上有标记 B B质粒具有某些标记基因质粒具有某些标记基因C C重组质粒能够复制重组质粒能够复制 D D以上都不正确以上都不正确D